RP-HPLC法同時測定香丹注射液中5-羥甲基糠醛和酚酸類成分的含量*

程巧鴛，郭增喜，陳碧蓮

(浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310004)

RP-HPLC法同時測定香丹注射液中5-羥甲基糠醛和酚酸類成分的含量*

程巧鴛，郭增喜，陳碧蓮

(浙江省食品藥品檢驗研究院，杭州 310004)

目的 建立同時測定香丹注射液中5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的反相高效液相色譜(RP-HPLC)法。方法 采用Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)色譜柱；流動相為乙腈-0.05%三氟乙酸溶液，梯度洗脫；檢測波長288 nm，柱溫30 ℃，流速0.8 mL·min-1。外標法計算含量。結果 5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的進樣量與峰面積分別在0.002 73～1.364 00 μg(r=1.000 0)、0.274 80～13.740 00 μg(r=0.999 9)、0.034 64～1.732 00 μg(r=1.000 0)、0.053 59～2.680 00 μg(r=1.000 0)及0.105 30～5.264 00 μg(r=1.000 0)呈良好的線性關系；平均加樣回收率依次為100.93%，101.36%，100.54%，105.14%，102.31%；RSD依次為1.00%，0.87%，0.51%，0.39%，1.91%。結論 該方法簡便快速，重復性好，適合于同時測定香丹注射液中5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸B和迷迭香酸的含量。

香丹注射液；5-羥甲基糠醛；丹參素鈉；原兒茶醛；迷迭香酸；丹酚酸B；色譜法，高效液相，反相

香丹注射液為臨床常用的中藥制劑，由丹參水提取液和降香經水蒸氣蒸餾后的飽和溶液制備而成，具有擴張血管、增進冠狀動脈血流量等作用，臨床上主要用于治療心絞痛、心肌梗死等。現行質量標準收載于《衛生部藥品標準》第17冊，“含量測定”項下僅控制原兒茶醛的含量[1]。研究表明，丹參的水溶性酚酸類$成分如丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B等均具有抗心肌缺血和缺氧的作用[2]。5-羥甲基糠醛是葡萄糖或果糖在高溫或酸性等條件下脫水產生的一個醛類化合物，普遍存在于中藥復方中，可導致橫紋肌損害和內臟損傷等不良反應[3-4]。筆者從中藥注射劑的有效性和安全性角度出發，建立同時測定香丹注射液中5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的反相高效液相色譜(RP-HPLC)法，以更好地控制制劑質量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1100 高效液相色譜儀(美國Agilent公司)，配備紫外檢測器。

1.2 試藥 5-羥甲基糠醛對照品(批號：111626-200804，純度>98%)，丹參素鈉對照品(批號：110855-200809，供含量測定用)、原兒茶醛對照品(批號：110810-200506，供含量測定用)、丹酚酸B對照品(批號：111562-200807，供含量測定用)、迷迭香酸對照品(批號：111871-201001，含量98.8%)均由中國食品藥品檢定研究院提供。乙腈為色譜純，水為重蒸水，其余為分析純。香丹注射液樣品來源于全國11家生產企業，共20批。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液的制備 取5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉對照品、原兒茶醛對照品、迷迭香酸對照品和丹酚酸B對照品適量，精密稱定，加0.2%醋酸的10%甲醇溶液制成每毫升含5- 羥甲基糠醛 2 μg、丹參素鈉0.20 mg、原兒茶醛50 μg、迷迭香酸50 μg和丹酚酸B 100 μg的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液及缺丹參陰性對照溶液的制備 精密量取本品2 mL，置10 mL量瓶中，加0.2%醋酸的10%甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。另取降香藥材，制備缺丹參陰性樣品溶液，精密量取上述溶液2 mL，同供試品溶液制備法制備缺丹參陰性對照溶液。

2.3 色譜條件 色譜柱Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為乙腈(A)-0.05%三氟乙酸水溶液(B)為流動相，線性梯度洗脫(0～65 min，2%→30%A，98%→0%B；～66 min，30%→2%A，70%→98%B)；檢測波長288 nm；柱溫40 ℃；流速0.8 mL·min-1；進樣體積5 μL。色譜圖見圖1。

2.4 線性關系的考察 分別精密吸取混合對照品溶液(每毫升含5-羥甲基糠醛2.728 μg、丹參素鈉0.274 8 mg、原兒茶醛34.64 μg、迷迭香酸53.59 μg、丹酚酸B 105.3 μg)1，2，5，10，20，30，50 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量(μg)為橫坐標，峰面積為縱坐標，作標準曲線，并以最小二乘法計算得回歸方程，見表1。

2.5 精密度實驗

2.5.1 儀器精密度 精密吸取同一供試品溶液，連續進樣6 次，所得5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B峰面積的RSD依次為1.25%，0.07%，0.05%，0.11%和0.34%，表明儀器精密度良好。

2.5.2 重復性實驗 精密吸取同一批樣品(批號110908s-1)各6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣5 μL，測定峰面積，計算得5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的RSD分別為0.58%，0.46%，0.45%，0.44%和0.36%。

A.缺丹參陰性對照溶液；B.混合對照品溶液；C.供試品溶液；1.5- 羥甲基糠醛；2.丹參素鈉；3.原兒茶醛；4.迷迭香酸；5.丹酚酸B

圖1 3種溶液的HPLC圖

A.negative control solution withoutSalviamiltiorrhiza；B.mixed reference solution；C.test solution；1.5- hydroxymethyl furfural；2.sodiumdanshensu；3.protocatechuic aldehyde；4.rosmarinic acid；5.salvianolic acid B

Fig.1 HPLC chromatogram of three kinds of solutions

表1 5種對照品的回歸方程、相關系數及線性范圍

Tab.1 Regression equations，correlation coefficient and linear range of five kinds of reference substance

2.6 穩定性實驗 取同一份供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，18和24 h進樣5 μL，測定峰面積，計算得5- 羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B含量的RSD分別為1.76%，0.13%，0.46%，0.15%和0.49%。

2.7 準確度 采用加樣回收率實驗法，精密量取已知含量樣品(批號110908s-1)1 mL，共6份，精密加入對照品適量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.3”項下色譜條件進樣分析，計算回收率，見表2。

表2 5種對照品加樣回收率測定結果

2.8 樣品測定 取不同企業生產的樣品，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，外標兩點法計算含量，結果見表3。

3 討論

3.1 檢測波長選擇 實驗中分別設置了230，254，270，288，320 nm波長進行測定，結果5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B在288 nm波長處的紫外吸收較強，且基線平穩，因此選擇288 nm作為檢測波長[5]。

3.2 流動相選擇 實驗中比較了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-醋酸、乙腈-醋酸、甲醇-磷酸、乙腈-磷酸體系，最后確定乙腈-0.03%磷酸體系對注射液中5-羥甲基糠醛、丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸、丹酚酸B分離效果較好。但國家藥典委員會要求將丹參系列品種的流動相進行統一，故對色譜系統進行調整，由乙腈-0.03%磷酸溶液改為乙腈-0.05%三氟乙酸溶液[6]。

3.3 耐用性考察 實驗中比較了不同酸度、不同流速、不同柱溫、不同儀器及不同色譜柱，包括不同品牌及同品牌不同批號色譜柱。結果發現，在一定范圍內，所得色譜圖基線平穩，分離效果較好，表明所建立的色譜條件耐用性較好。

本實驗采用HPLC法同時測定了香丹注射液中5種成分的含量，結果顯示該方法靈敏度高，重復性好，樣品處理方法簡單，可作為香丹注射液質量控制的方法。從測定結果看，不同企業生產的樣品中5-羥甲基糠醛的含量差異顯著。由于不同企業采用的原藥材及規格均為每支10 mL生產工藝均有所不同，且5-羥甲基糠醛會隨著加熱時間、酸度、溫度、儲藏而發生變化，因此亟需對其制定合理的限度以降低安全風險[7]。此外，不同企業生產的樣品其有效成分丹參素鈉、原兒茶醛、迷迭香酸和丹酚酸B的含量差異也較顯著，因此亟待提高現行質量標準以更好地控制產品質量。

[1] 中華人民共和國衛生部藥典委員會.衛生部藥品標準中藥成方制劑第十七冊[S].1998：200.

[2] 趙娜，郭治昕，趙雪，等.丹參的化學成分與藥理作用[J].國外醫藥(植物藥分冊)，2007，22(4)：155-160.

[3] ULBRICHT R J，NORTHUP S J，THOMAS J A.A review of 5-hydroxymethylfurfural(HMF) in parenteral solutions[J].Fundam Appl Toxicol，1984，4(5)：843-853.

[4] 閆琰，鄢丹，張萍，等.中藥注射劑不良反應早期預警方法的研究(I)——安全相關物質5-羥甲基糠醛的研究[J].中華中醫藥雜志，2010，25(12)：2268-2270.

[5] 袁繼承，尹永芹，沈志濱，等.HPLC法測定香丹注射液中丹參素、原兒茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B和丹酚酸A[J].中草藥：英文版，2009，40(增刊 1)：128-131.

[6] 徐曼，劉愛華，崔亞君，等.不同廠家生產的香丹注射液中丹參色譜指紋圖譜的比對研究[J].中國天然藥物，2007，5(2)：120-126.

[7] 艾則孜·穆合買提，賀玖明，孫江浩.中藥注射液中5-羥甲基糠醛含量測定的LC-MS/MS分析方法研究[J].藥物分析雜志，2010，30(7)：1195-1198.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.025

Simultaneous Determination of 5-Hydroxymethylfurfural and Phenolic Acids inXiangdanInjection by RP-HPLC

CHENG Qiaoyuan,GUO Zengxi, CHEN Bilian

(ZhejiangInstituteforFoodandDrugControl,Hangzhou310004,China)

Objective To establish a method for content determination of 5-hydroxymethylfurfural, sodiumdanshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinci acid and salvianolic acid B inxiangdaninjection by reversed phase high performance liquid chromatography (RP-HPLC) . Methods The analysis was performed on a Kromasil C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)column with acetonitrile-0.05% water solution of trifluoroacetic acid as mobile phase at the gradient elution mode with the flow rate of 0.8 mL·min-1.The column temperature was kept at 30 ℃ and the detector wavelength was set at 288 nm.The content was calculated with external standard method. Results The linear relationships between the concentration and peak area of 5-hydroxymethylfurfural, sodiumdanshensu, protocatechuic aldehyde, rosmarinci acid and salvianolic acid B were 0.002 73-1.364 00 μg(r=1), 0.274 80-13.740 00 μg(r=0.999 9),0.034 64-1.732 00 μg(r=1.000 0), 0.053 59-2.680 00 μg(r=1.000 0), and 0.105 30-5.264 00 μg(r=1.000 0), respectively.The average recovery and the RSD of the five components were 100.93%(1.00%)，101.36%(0.87%)，100.54%(0.51%)，105.14%(0.39%)，and 102.31%(1.91%), respectively. Conclusion This method has been proven to be simple, fast, reliable and reproducibile, which can be applied to the content determination of the five components inxiangdaninjection.

Xiangdaninjection; 5-Hydroxymethylfurfural; Sodiumdanshensu;Protocatechuic aldehyde; Rosmarinci acid; Salvianolic acid B; Chromatography,high performance liquid,reversed phase

2014-01-03

2014-06-16

*浙江省自然科學基金資助項目(LQ12H28001)

程巧鴛(1981-)，女，浙江永康人，副主任藥師，博士，主要從事中藥質量及其安全性研究。電話：0571-86459425，E-mail：cqy_427@126.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)01-0095-04