貴州產(chǎn)杜仲高效液相色譜指紋圖譜的建立與分析*

劉星，周欣，周美，陳華國，龔小見

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)系，貴陽 550002；2.貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴陽 550001；3.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴陽 550001)

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

貴州產(chǎn)杜仲高效液相色譜指紋圖譜的建立與分析*

劉星1，2，周欣2，3，周美2，3，陳華國2，3，龔小見2，3

(1.貴陽中醫(yī)學(xué)院中藥學(xué)系，貴陽 550002；2.貴州師范大學(xué)天然藥物質(zhì)量控制研究中心，貴陽 550001；3.貴州省山地環(huán)境信息系統(tǒng)與生態(tài)環(huán)境保護重點實驗室，貴陽 550001)

目的 建立杜仲藥材高效液相色譜(HPLC)的指紋圖譜，評價不同產(chǎn)地杜仲中化學(xué)成分的差異，為制定杜仲的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供參考。方法 色譜柱為Phenomenex Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)，流動相為甲醇-0.05%磷酸溶液(梯度洗脫)，檢測波長235 nm，柱溫25 ℃。利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)軟件進行相似度計算，并應(yīng)用聚類分析與主成分分析對指紋圖譜進行化學(xué)模式識別法研究。結(jié)果 建立了杜仲藥材的指紋圖譜，確定了19個共有峰，并用對照品指認了3個峰。相似度評價表明，20批不同產(chǎn)地的杜仲藥材相似度存在差異；聚類分析將20個樣品分成A與B兩類。結(jié)論 杜仲藥材指紋圖譜的建立為杜仲的質(zhì)量控制評價體系提供了科學(xué)依據(jù)。

杜仲；色譜法，高效液相；聚類分析；指紋圖譜

杜仲為杜仲科落葉喬木杜仲(EucommiaulmoidesOliv.)的干燥樹皮。杜仲已有2 000多年的入藥歷史，具有補肝腎、強筋骨、安胎、輕身耐老之功效[1]。《中華人民共和國藥典》2010年版一部收載杜仲藥材，同時規(guī)定了其中松脂醇二葡萄糖苷的含量測定標(biāo)準(zhǔn)[2]。文獻記載，杜仲經(jīng)炮制后指紋峰數(shù)與生藥材相比有所變化[3-4]。目前，人們多通過高效毛細管電泳法、紫外光譜法、薄層色譜法、高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)和高效液相色譜(HPLC)法對國內(nèi)不同產(chǎn)地杜仲藥材進行指紋圖譜研究，但對于道地產(chǎn)區(qū)的貴州產(chǎn)杜仲藥材的指紋圖譜研究不夠詳細[5-8]，只簡單進行了松脂醇二葡萄糖苷和綠原酸的指認[9]，不能很好評價貴州產(chǎn)杜仲藥材的質(zhì)量。筆者在本實驗中采用HPLC法，建立了杜仲藥材的特征圖譜測試方法，并對貴州20個產(chǎn)地杜仲藥材樣品進行系統(tǒng)研究和統(tǒng)計學(xué)分析，為科學(xué)評價杜仲藥材的品質(zhì)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DIONEX Ultimate 3000(包括四元泵處理器、自動進樣器、RS柱溫箱、二極管陣列檢測器以及 Chromeleon 7.1 色譜工作站)，色譜柱：Phenomenex Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)，KQ5200E型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)，AL204萬分之一電子分析天平和XS-105DU十萬分之一電子分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]。

1.2 試藥 杜仲皮樣品見表1。經(jīng)貴陽中醫(yī)學(xué)院陳德媛教授鑒定為杜仲科植物(EucommiaulmoidesOliv.)的干燥樹皮。綠原酸對照品、京尼平苷酸對照品(均購于中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110753-201314，111828-201102)、松脂醇二葡萄糖苷對照品(購于貴州迪大生物有限公司，批號：0794-201106)，甲醇為色譜純(TEDIA COMPANY，INC.，批號：911900)，磷酸[重慶川東化工(集團)有限公司，分析純]，其余試劑為分析純，水為實驗室自制純化水。

表1 不同地區(qū)的杜仲樣品

Tab.1 Eucommia bark samples from different regions

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱Phenomenex Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm)；流動相：甲醇(A)-0.05%磷酸水(B)；梯度洗脫，洗脫程序為：0～5 min，10%→25%A；～8 min，25%A；～15 min，25%→30% A；～25 min，30%→40% A；～30 min，40%→45% A；～38 min，45%→55% A；～45 min，55%→70% A；～50 min，70%→90% A；～55 min，90%→95% A；～60 min，95% A；檢測波長235 nm；流速1 mL·min-1；柱溫25 ℃；進樣量10 μL。

2.2 樣品溶液的制備 根據(jù)前期研究，確定了本實驗最佳的提取工藝[10]，取杜仲粉末1.0 g，精密稱定，置具塞的錐形瓶中，加入26%乙醇13 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取25 min，冷卻稱質(zhì)量，用26%乙醇補足失去的質(zhì)量，過濾，取續(xù)濾液，過孔徑0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.3 對照品溶液的制備 稱取京尼平苷酸對照品6.41 mg、綠原酸對照品3.9 mg、松脂醇二葡萄糖苷對照品4.67 mg、咖啡酸對照品4.66 mg置于10 mL量瓶中，50%甲醇定容，即得。

2.4 樣品測定 取各樣品溶液和對照品溶液10 μL，分別注入高效液相色譜儀中，按“2.1”項下條件下測定，記錄色譜圖S1～S20。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度實驗 取編號S2杜仲粉末1份，按照“2.2”項下提取制備供試液，并按“2.1”項下色譜條件重復(fù)進樣6次，各共有峰的相對保留時間的RSD均<0.1%，相對峰面積的RSD均<1.5%，精密度良好。

2.5.2 重復(fù)性實驗 取編號S2杜仲粉末6份，按照“2.2”項下提取制備供試液，并按“2.1”項下色譜條件分別進樣，各共有峰的相對保留時間的RSD均<0.1%，相對峰面積的RSD均<2.5%，重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性實驗 取編號S2杜仲粉末1份，按照“2.2”項下提取制備供試液，并按“2.1”項下色譜條件，分別于0，3，6，12，24，36 h進樣，各共有峰的相對保留時間RSD均<0.1%，相對峰面積RSD均<1.9%，穩(wěn)定性良好。

2.6 杜仲藥材指紋圖譜的建立與分析

2.6.1 指紋圖譜的建立 精密稱定杜仲藥材粉末1.0 g，按“2.1”項下色譜條件測定，得到20批不同來源的杜仲藥材色譜圖，20批不同來源杜仲藥材指紋圖譜色譜峰見圖1(R為共有模式)。采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)(2004年A版)”分析，以S2產(chǎn)地樣品的色譜圖為參照圖譜，平均數(shù)生成法，選取時間寬度為0.10 min，采用多點校正方式，生成杜仲藥材指紋圖譜共有模式，得到19個特征峰。通過保留時間對比法，比較對照品與樣品中各色譜峰保留時間，指認出3個色譜峰的峰歸屬，其中1號峰為京尼平苷酸(Rt=8.92 min)；2號峰為綠原酸(Rt=15.81 min)；3號峰為松脂醇二葡萄糖苷(Rt=20.21 min)，樣品與對照品的HPLC色譜圖見圖2。

a.樣品；b.對照品；1.京尼平苷酸；2.綠原酸；3.松脂醇二葡萄糖苷

圖2 樣品(S2)與對照品的鏡面圖

a.sample；b.reference substance；1.geniposidic acid；2.chlorogenic acid；3.pinoresinol diglucoside

Fig.2 Specular chromatogram of sample(S2) and reference substance

設(shè)1號峰為內(nèi)參比峰，因其峰面積較大，分離度較好。各特征峰在共有模式中的保留時間、峰面積相對于1號峰的相對保留時間和相對峰面積見表2。

2.6.2 相似度分析 對照用指紋圖譜和20批樣品圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”(2004年A版)，根據(jù)20批樣品相對保留時間及指紋圖譜的整體譜峰特點，以相關(guān)系數(shù)法對樣品的相似度進行評價，各樣品相似度見表3所示。

從相似度可以看出，整體色譜峰存在差異，不同產(chǎn)地的杜仲與共有模式色譜峰比較，相似度不同，峰面積不等，樣品(S5)與共有模式的相似度差異最大，貴州省內(nèi)的杜仲藥材之間的化學(xué)成分和成分含量有較大不同。

表2 20批杜仲藥材特征峰的相對保留時間及相對峰面積

Tab.2 Relative retention time and relative peak area of characteristic peak for 20 batches ofEucommiaulmoidesOliv

2.6.3 聚類分析 將20個不同產(chǎn)地的杜仲樣品進行聚類分析，利用SPSS 20.0版統(tǒng)計軟件，對20個樣品所含的共有峰的峰面積作為特征峰，采用離差平方和(Wards’ method)和歐氏距離(Euclidean distance)進行聚類，所得聚類分析樹狀圖，見圖3。

表3 20批杜仲藥材的相似度

Tab.3 Similarity of 20 batches ofEucommiaulmoidesOliv.

Fig.3 Cluster analysis dendrogram of 20 batches ofEucommiaulmoidesOliv.

樣品被劃分為A與B兩類。其中，A類進一步進行分類，被劃分為A1、A2兩類；B類同樣進一步分類，被劃分為B1、B2兩類。閾值=11時，樣品可分為五類，第一類包括1，2，6，9號藥材；第二類包括11號藥材；第三類包括3，5，7，8，12，13，15，18，19號藥材；第四類包括10，14，16，17號藥材；第五類包括4，20號藥材。

2.6.4 主成分分析 將20批不同產(chǎn)地的杜仲樣品進行主成分分析，根據(jù)20批杜仲樣品中HPLC指紋圖譜中19個共有峰的峰面積，選取面積較大的主要共有峰作為指標(biāo)，采用Simca-P 11.50版軟件對20批杜仲樣品進行主成分分析，以選取的14個共有峰為變量，進行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理后，得到杜仲藥材主成分分析二維得分圖(圖4)。

Fig.4 Two-dimensional scoring figure of principal component analysis on 20 batches ofEucommiaulmoidesOliv

結(jié)果顯示，樣品之間距離越大，相似性越差。由二維得分圖可知，20個樣品被分為5類，與聚類分析結(jié)果一致。

3 討論

筆者對20批貴州產(chǎn)杜仲藥材進行了HPLC指紋圖譜數(shù)據(jù)采集，利用相似度評價軟件進行分析，建立了杜仲藥材HPLC指紋圖譜的共有模式，并得到了杜仲藥材指紋圖譜的19個特征峰。來源于野生的2號藥材，與共有模式比較，其相似度為0.967，表明杜仲HPLC指紋圖譜的共有模式可用于整體評價杜仲藥材的品質(zhì)，有利于杜仲藥材的規(guī)范化種植。

藥物指紋圖譜色譜峰的峰歸屬難以確定，所以其具有模糊性的弱點。為了更好評價貴州產(chǎn)杜仲藥材的質(zhì)量，筆者采用保留時間對比法，指認出京尼平苷酸、綠原酸和松脂醇二葡萄糖苷的峰歸屬，3種化合物的相對峰面積較大，面積之和占所有峰面積的50%以上，同時這3種化合物具有較高的藥理活性。這3種化合物的指認與HPLC指紋圖譜共有模式相輔相成，為評價貴州杜仲藥材的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)提供了更好的依據(jù)。

化學(xué)計量學(xué)方法運用于中藥指紋圖譜的數(shù)據(jù)處理，使得更多的傳統(tǒng)中藥材、中成藥的真?zhèn)舞b定、質(zhì)量評定工作得以實現(xiàn)[11]。筆者應(yīng)用HPLC法對20個杜仲樣品進行指紋圖譜的測定，并應(yīng)用化學(xué)計量學(xué)方法，進行聚類分析和主成分分析，不同產(chǎn)地的杜仲藥材得到了很好的聚類效果，主成分分析的二維得分圖與聚類分析得到的結(jié)果一致，形成了貴州產(chǎn)杜仲藥材化學(xué)模式識別的模板，可用于比較與其他產(chǎn)地杜仲藥材的差異。從其指紋圖譜來看，第一類藥材中，2，9號藥材中京尼平苷酸較1，6號藥材含量多；第二類藥材與第一類藥材相比京尼平苷酸含量較少，但綠原酸含量較多，與S1相似；第三類藥材中，其峰面積大小與指紋峰數(shù)差異較小，但各樣品中京尼平苷酸含量有差別；第四類藥材中差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第五類藥材中，4號藥材綠原酸含量較少，其他峰面積大小與指紋峰數(shù)差異較小。17，20號藥材除峰面積大小有差異，其他差異較?。?5，16號藥材均采自貴陽市，但指紋峰數(shù)與峰面積差異較大。

綜上所述，樣品雖均產(chǎn)自貴州省，但可能是因為地理位置、氣候、日照、生物分布的不同，對樣品內(nèi)在化學(xué)物質(zhì)有一定的影響，即所含化學(xué)成分的種類和含量有差別。從方法學(xué)考察可知，本實驗的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，有效評價了道地產(chǎn)區(qū)貴州少杜仲藥材的質(zhì)量。該方法簡便、快捷，可為控制和評價貴州產(chǎn)杜仲藥材的整體質(zhì)量提供參考。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.023

Establishment and Analysis of HPLC FingerprintEucommiaUlmoidesOliv.fromGuizhou

LIU Xing1,2, ZHOU Xin2,3,ZHOU Mei2,3,CHEN Huaguo2,3, GONG Xiaojian2,3

(1.DepartmentofTraditionalChineseMedicine,GuiyangCollegeofTraditionalChineseMedicine,Guiyang550002，China; 2.TheResearchCenterforQualityControlofNaturalMedicine，GuizhouNormalUniversity，Guiyang550001，China; 3.KeyLaboratoryforInformationSystemofMountainousAreasandProtectionofEcologicalEnvironment，Guiyang550001，China)

Objective To establish the high performance liquid chromatography (HPLC) fingerprint ofEucommiaulmoidesOliv.and compare the contents of chemical components ofEucommiaulmoidesOliv.from different habitats,which provides a reference for the development of the quality control standards ofEucommiaulmoidesOliv. Methods The chromatographic separation was performed on a Phenomenex Synergi Hydro-RP C18(250 mm×4.6 mm，4 μm) column with a mixture of methanol-0.05% phosphoric acid (gradient elution) as the mobile phase.The detection wavelength was set at 235 nm, and column temperature was kept at 25 ℃.The similarity was evaluated with the traditional Chinese medicine chromatographic fingerprint similarity evaluation software system.Hierarchical cluster analysis and principal component analysis were applied for the chemical fingerprint pattern recognition. Results The HPLC fingerprint ofEucommiaulmoidesOliv.was set up, 19 common peaks were determined, and three peaks were identified compared to reference substances.The similarity evaluation showed differences among twentyEucommiaulmoidesOliv.samples from different areas, dividing them into classes A and B by the hierarchical cluster analysis. Conclusion The fingerprint ofEucommiaulmoidesOliv.provides evidences for the quality control evaluation of it.

EucommiaulmoidesOliv.; Chromatography,high performance liquid; Hierarchical cluster analysis; Fingerprint

2013-11-25

2014-02-09

*貴州省重大科技專項計劃項目(黔科合重大專項字[2012]6009號)；貴州省中藥現(xiàn)代化科技產(chǎn)業(yè)研究開發(fā)專項項目(黔科合ZY[2011]3013

劉星(1988-)，女，遼寧遼中人，碩士，研究方向：中藥質(zhì)量控制及藥物代謝的研究。電話：0851-6700414，E-mail：liuxing13578771405@163.com

周欣(1962-)，女，貴州貴陽人，教授，博士，研究方向：中藥和民族藥質(zhì)量控制、中藥指紋圖譜以及中藥新藥研究開發(fā)。電話：0851-6700494，E-mail：alice9800@sina.com。

R282.71；R927

B

1004-0781(2015)01-0084-05