轉移性結直腸癌anti-EGFR治療耐藥分子標志物的研究進展*

潘映秋，章衛國，官正東，石衛武

(溫州醫科大學附屬浙江省臺州醫院1.中心實驗室；2.麻醉科，臨海 317000)

·藥學進展·

轉移性結直腸癌anti-EGFR治療耐藥分子標志物的研究進展*

潘映秋1，章衛國1，官正東2，石衛武1

(溫州醫科大學附屬浙江省臺州醫院1.中心實驗室；2.麻醉科，臨海 317000)

治療轉移性結直腸癌(mCRC)的表皮生長因子受體(EGFR)單克隆抗體(anti-EGFR)靶向藥物包括西妥昔單抗和帕尼單抗。靶向藥物治療mCRC達到了增加療效和延長生存期的效果，但是部分患者對該類藥物存在不敏感或耐藥現象，其機制尚未完全揭示。伴隨著EGFR信號通路研究的深入，越來越多的anti-EGFR治療的耐藥分子標志物被發現。KRAS突變是目前僅知的具有真正臨床意義的anti-EGFR單抗治療mCRC的獨立耐藥預測因素。此外EGFR基因拷貝數的改變，NRAS、BRAF、PIK3CA等基因突變，PTEN蛋白的失活，EGFR配體AREG/EREG的mRNA表達水平及miRNA Let-7 LCS6的多態性等都可能與anti-EGFR單抗治療mCRC耐藥相關。通過回顧近年來報道的西妥昔單抗和帕尼單抗治療mCRC耐藥相關的分子標志物，對其研究進展進行綜述。

癌，結腸；癌，直腸；表皮生長因子受體；靶向治療；耐藥

結直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性消化道腫瘤之一，5年生存率60%，主要死亡原因為CRC的轉移[1]。近年來，靶向抗腫瘤藥物的出現，包括靶向表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)的單克隆抗體(EGFR monoclonal antibody，anti-EGFR)藥物在轉移性結直腸癌(metastatic colorectal cancer，mCRC)治療中的應用，使越來越多的患者獲益，提高療效并延長生存時間[2]。然而，在臨床應用的過程中，僅有10%～20%的mCRC患者可以從anti-EGFR治療中獲益，大部分患者對該類藥物不敏感或存在耐藥現象。由于該類藥物價格昂貴，且存在一些無法避免的不良反應，因此如何篩選出可以從該類藥物治療方案獲益的患者，是現今研究的熱點。

EGFR為跨膜酪氨酸激酶受體，可以與不同配體結合發生磷酸化，形成二聚體激活下游MAPK和PI3K信號通路，參與腫瘤的發生發展[3]。以EGFR為靶向的藥物，可阻斷EGFR對下游信號傳導通路的活化，治療腫瘤[4]。目前，以EGFR為靶點的抑制藥包括作用于EGFR受體胞外區的單克隆抗體和作用于EGFR受體胞內的酪氨酸激酶抑制藥兩類[5]。用于治療mCRC的主要為靶向EGFR的單克隆抗體藥物，包括西妥昔單抗和帕尼單抗。西妥昔單抗是一種EGFR的人鼠嵌合型單克隆抗體，靶向EGFR胞外結構，競爭性地抑制其與相關配體的結合，起到抗腫瘤的作用。帕尼單抗則是一種完全人源化的EGFR單克隆抗體，作用機制與西妥昔單抗類似，耐受性更好。

在應用anti-EGER單抗治療腫瘤初期，認為該類藥物僅對EGFR表達陽性的腫瘤患者有效，但在實際的應用過程中發現EGFR表達情況與藥物治療效果并無相關性。因此，研究者對EGFR信號傳導通路中的其他相關分子進行了大量的研究，越來越多的潛在的耐藥分子機制被揭示，涉及多種基因、蛋白及相關信號分子的異常表達和活化。

1 anti-EGFR治療mCRC耐藥相關分子標志物

1.1 EGFR 大量研究證實，EGFR基因拷貝數(gene copy number，GCN)的異常增加與西妥昔單抗和帕尼單抗治療mCRC療效相關。MORONI等[6]最先使用FISH技術檢測EGFR GCN，證實EGFR GCN與西妥昔單抗和帕尼單抗治療mCRC療效相關。LAURENT-PUIG等[7]發現EGFR GCN異常增加患者的總有效率(71%)明顯高于正常EGFR GCN(37%)患者。LI等[8]結合EGFR GCN和KRAS突變狀態分析了74例接受西妥昔單抗治療的mCRC患者的治療效果，發現在KRAS野生型患者中，EGFR GCN FISH結果陽性(GCN>3)的患者總有效率和無進展生存期明顯優于陰性患者。因此，EGFR GCN是一個有前景的anti-EGFR治療mCRC療效的預測因子。但在將該結論運用于臨床之前，需要更多的研究數據支持，其檢測方法和陽性判斷閾值都必須進一步標準化和規范化。

1.2 KRAS KRAS是EGFR下游RAS-RAF-MAPK通路的關鍵信號傳導分子，發生突變后將處于持續活化狀態，使機體失去對EGFR下游通路的控制，導致腫瘤對anti-EGFR單抗耐藥[9]。KRAS基因突變主要發生在外顯子2的12位和13位密碼子，其中12位密碼子突變占KRAS基因突變的70%～80%，13位密碼子突變占15%～20%，是目前僅知的具有真正臨床意義的anti-EGFR治療mCRC的獨立耐藥預測因素。研究證實，KRAS突變會導致mCRC患者對西妥昔單抗耐藥[10-11]。DOUILLARD等[12]研究則發現KRAS突變會導致CRC患者對帕尼單抗耐藥。葛飛嬌等[13]回顧性分析了153例不同KRAS基因型的mCRC患者的臨床特征、治療方案和生存情況，發現KRAS野生型患者預后優于突變型。張斌等[14]評價了KRAS基因突變狀態與西妥昔/帕尼單抗治療mCRC 療效間的關系，結果顯示存在KRAS基因突變的患者對anti-EGFR治療反應較差。除上述突變外，KRAS基因其余突變主要發生在61，146和154位密碼子，有研究指出不同類型的KRAS突變對anti-EGFR治療的耐藥作用存在差異，但這部分的研究報道較少，仍待探索[15]。

此外，VALTORTA等[16]分析了1 039例CRC患者KRAS基因GCN的改變，發現0.67%患者KRAS GCN增加，且均為KRAS野生型，并對anti-EGFR單抗治療無應答。盡管KRAS GCN增加發生的概率不高，研究報道也較少，但是這很可能是anti-EGFR單抗治療mCRC發生耐藥的分子機制之一。

1.3 NRAS NRAS是RAS致癌基因家族的成員之一，與KRAS高度同源，在CRC中的突變率為3%～5%，主要發生在61位密碼子，其次發生在12和13位密碼子，其突變與KRAS突變不共存[17]。研究發現KRAS野生型CRC患者中，NRAS突變型較NRAS野生型總生存期明顯縮短，且與治療方案無關[18]。擴大基因檢測譜，聯合檢測KRAS外顯子2，3，4和NRAS基因突變，將KRAS和NRAS均為野生型的患者定義為RAS野生型患者，評估帕尼單抗聯合FOLFOX一線治療轉移性結直腸癌的療效。結果發現KRAS第2外顯子為野生型的患者有20%存在第3，4外顯子或NRAS的突變，且不能從帕尼單抗的一線治療中獲益。而RAS野生型患者在帕尼單抗聯合化療的治療中則顯著獲益，無進展生存期和總生存期均顯著延長[19]。該研究提示，結合KRAS和NRAS的多個突變位點，擴大耐藥基因檢測譜，將有助于篩選出更多的anti-EGFR單抗耐藥mCRC患者。

1.4 BRAF BRAF蛋白位于EGFR通路的KRAS分子下游，KRAS磷酸化活化BRAF后，再激活多種MAP激酶活化MEK/ERK通路，促進腫瘤增殖和侵襲。BRAF和KRAS突變一般不會同時發生，V600E是最常見的BRAF突變類型，占BRAF突變的95%，在約15%的CRC患者中存在[20]。DI NICOLANTONIO等[21]在79例KRAS野生型mCRC患者中發現11例存在BRAF V600E突變，這11例患者對西妥昔單抗和帕尼單抗治療無應答，且BRAF突變型mCRC患者的無進展生存期和總生存期明顯短于BRAF野生型患者。YUAN等[20]系統性地評價了BRAF突變與anti-EGFR單抗藥物治療mCRC療效之間的關系，該報道納入21項研究的5 229例mCRC患者，結果表明BRAF野生型患者可通過anti-EGFR單抗藥物治療獲益，尤其是在KRAS野生型患者中BRAF野生型患者較突變型無進展生存期和總生存期顯著延長。以上研究均提示KRAS野生型患者進一步進行BRAF V600E位點的檢測，將有助于篩選出一部分anti-EGFR治療耐藥患者。

1.5 PTEN和PIK3A PI3K-PTEN-AKT為EGFR另一條重要的信號傳導通路。PTEN可通過脫磷酸化抑制PI3K-AKT通路活化，起抑癌作用，而PI3K則可通過磷酸化促進PI3K-AKT通路活化，起致癌作用。PTEN缺失和PIK3A基因突變都會導致PI3K效應子持續活化，促進腫瘤的發生發展。

研究顯示，19%～42%的CRC患者PTEN蛋白表達缺失，其缺失可與KRAS、BRAF、PIK3A突變及EGFR GCN增加共存[7]。此外，10%～20%的CRC患者存在PIK3CA的活化突變，80%為PIK3CA的單堿基替代突變，其中60%～65%發生在外顯子9(G1624A和E542K)，20%～25%發生在外顯子20(A3140G和H1047R)，其突變可以與KRAS和BRAF突變共存[17]。RAZIS等[22]回顧性分析了147例接受西妥昔單抗治療的mCRC患者的PTEN蛋白表達情況，發現PTEN表達陽性的KRAS野生型患者的疾病進展時間顯著延長。SARTORE-BIANCHI等[23]的研究指出在接受西妥昔單抗或帕尼單抗治療的KRAS野生型CRC患者中，PIK3CA突變患者的總有效率顯著低于PIK3CA野生型患者，且無進展生存期明顯縮短。THERKILDSEN等[24]系統性評價KRAS野生型患者中PIK3CA突變和PTEN蛋白功能缺失與西妥昔單抗和帕尼單抗治療mCRC療效之間的相關性，納入22項研究的mCRC患者2 395例，結果發現PIK3CA突變和PTEN蛋白功能缺失患者的無進展生存期和總生存期顯著縮短。但PTEN蛋白表達及PIK3CA突變與anti-EGFR單抗藥物治療效果之間的相關性還存在爭議，其原因可能在于PTEN蛋白和PIK3CA基因異?？梢耘cKRAS、BRAF等多種基因、蛋白異常共存，較難作為獨立的預測因子，需要綜合分析多種相關因素才能得出有效、準確的結論。

1.6 表皮調節素(epiregulin，EREG)和雙調蛋白(amphiregulin，AREG) EREG 和AREG 為EGFR的配體，回顧性研究已經證實其表達水平在KRAS野生型CRC中可以作為anti-EGFR靶向藥物的藥效預測指標。JACOBS等[25]分析了西妥昔和伊立替康聯用治療的mCRC患者的AREG和EREG的mRNA表達水平，發現在KRAS野生型患者中，AREG和EREG mRNA高表達患者治療應答顯著升高，無進展生存期顯著延長，而在KRAS突變型患者中則無差異。PENTHEROUDAKIS等[26]檢測了226 例接受西妥昔單抗治療的mCRC患者EREG和AREG的mRNA表達水平。結果發現 KRAS野生型患者中，AREG高表達與總生存期相關(HR0.47，95%CI0.3～0.7)，其高表達有助于KRAS野生型患者從西妥昔治療中獲益；而EREG高表達與總生存期的相關性(HR0.45，95%CI0.28～0.70)與KRAS基因狀態無關，提示EREG可能可以作為不依賴于KRAS基因突變狀態的一個獨立的療效預測指標?；谝陨涎芯拷Y果，AREG和EREG的表達水平可作為mCRC患者anti-EGFR治療療效的預測因子，但該類研究數據量不大，尚缺乏規范的檢測手段和判斷標準，需要多中心、大規模的研究來獲得更準確的結論。

1.7 Micro-RNA Micro-RNA為非編碼小RNA，可以通過與mRNA相應位點的結合來調控基因表達，其多態性存在于miRNA與功能基因結合位點附近，通過干擾miRNA功能影響功能基因的表達，干擾藥物應答導致耐藥[27]。miRNA中Let-7家族可結合至KRAS mRNA 3′端非翻譯區的互補位點(complementary site，LCS)，下調RAS表達。KRAS mRNA 3′端非翻譯區的Let-7的LCS6若發生單堿基突變T>G(rs61764370)，其與KRAS mRNA的結合能力可發生改變[28]。GRAZIANO等[29]發現LCS6 GG或GT單堿基突變的mCRC患者西妥昔單抗治療療效更好。因此Let-7 LCS6多態性可預測西妥昔單抗治療mCRC的療效，是一個很有前景的耐藥預測分子標志物。但相關研究數據都是建立在回顧性分析基礎上，數據較少，缺乏多中心大范圍前瞻性的研究數據支持。

1.8 其他 Met受體激酶途徑是新提出的可能導致anti-EGFR治療mCRC產生耐藥的機制之一，Met的活化可激活EGFR下游信號傳導通路。INNO等[30]報道在73例接受西妥昔單抗治療的mCRC 患者中，c-Met過表達與耐藥相關。HEINDL等[31]也報道了Met的高表達與EGFR活化相關，并可導致西妥昔單抗耐藥。此外，表皮生長因子受體-2(HER-2)、胰島素樣生長因子1(insulin-like growth factor 1，IGF-1)/IGF-1R、Fc-γ(fragment c gamma)受體、環氧化酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)、EGFR信號通路下游調控基因cyclin-D1等均報道與anti-EGFR單抗治療mCRC中產生耐藥存在一定的相關性，但是結果尚有爭議，有待深入研究。

2 結束語

目前，臨床應用西妥昔單抗和帕尼單抗治療mCRC前，可通過檢測患者KRAS基因狀態，針對個體情況選擇用藥方案。盡管KRAS突變患者幾乎全都對該類藥物耐藥，但其敏感度不高，尚無有效指標對KRAS野生型患者中的耐藥患者進行進一步的篩選。

研究發現，EGFR GCN，NRAS、BRAF、PIK3CA的突變，PTEN表達缺失，AREG/EREG的mRNA表達水平及miRNA Let-7 LCS6的多態性等與anti-EGFR單抗治療mCRC的療效存在一定關聯，是具有臨床應用前景的耐藥預測分子標志物。通過多中心大數據的前瞻性的研究，聯合分析CRC患者EGFR信號傳導通路中的多個相關分子標志物，建立標準化和規范化的檢測手段和分析方法，對各相關分子標志物的預測作用進行確認，最終轉化至臨床應用，必將有助于提高預測疾病預后及相關藥物療效的準確率，可以更好地指導臨床個體化用藥。

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DOI 10.3870/yydb.2015.01.021

2014-02-19

2014-05-30

*浙江省公益性技術應用研究計劃(2014C33157)；浙江省醫藥衛生科技計劃(2014KYA225)

潘映秋(1983-)，女，浙江臺州人，助理研究員，碩士，主要研究方向：藥物基因組學。電話：0576-85199344，E-mail：panyq@enzemed.com。

石衛武(1975-)，男，浙江臺州人，副主任技師，主要研究方向：臨床基因診斷。電話：0576-85199344，E-mail：shiww@enzemed.com。

R979.1；R735.3

A

1004-0781(2015)01-0077-05