多重耐藥鮑曼不動桿菌的主動外排泵基因對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥性的影響*

孫靜娜，楊繼章，王國欣，趙帥，劉澤世，張征

(河北醫科大學第一醫院1.檢驗科；2.藥學部，石家莊 050031)

多重耐藥鮑曼不動桿菌的主動外排泵基因對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥性的影響*

孫靜娜1，楊繼章2，王國欣1，趙帥1，劉澤世1，張征1

(河北醫科大學第一醫院1.檢驗科；2.藥學部，石家莊 050031)

目的 探討對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的多重耐藥鮑曼不動桿菌主動外排泵基因在耐藥機制中表達情況。方法 多重耐藥鮑曼不動桿菌96株，分析其對9種β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥性。以加入泵抑制劑羰基氰氯苯腙(CCCP)后最低抑菌濃度(MIC)降低至≤1/4為標準，篩選出34株外排泵表型陽性的鮑曼不動桿菌，用聚合酶聯鏈反應(PCR)擴增法對其行外排泵蛋白基因adeB進行檢測和分析。結果 多重耐藥鮑曼不動桿菌對頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢曲松、頭孢吡肟、頭孢哌酮/舒巴坦的耐藥率分別為92.3%，86.6%，83.0%，70.8%，68.3%；對氨芐西林、哌拉西林、哌拉西林/他唑巴坦、氨芐西林/舒巴坦的耐藥率分別為90.1%，77.5%，72.4%和67.3%。34株外排泵表型陽性的鮑曼不動桿菌檢測到adeB基因有33株，檢出陽性率97.06%。對33株鮑曼不動桿菌的外排泵基因adeB進行測序，經比對所測序列與Genebank中序列同源性為100.0%。結論 主動外排泵基因是多重耐藥鮑曼不動桿菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的一個重要因素。

鮑曼不動桿菌；多重耐藥；外排泵；β-內酰胺酶

多重耐藥鮑曼不動桿菌在住院患者，尤其在重癥監護室、嚴重燒傷病房的耐藥菌株的出現，給臨床抗感染治療帶來很大困難。其中，多藥外排系統是鮑曼不動桿菌多重耐藥的一個重要原因。特別是AdeABC外排泵參與了鮑曼不動桿菌對氨基苷類藥物、β-內酰胺類藥物、氯霉素、紅霉素和四環素的耐藥。筆者通過96株多重耐藥鮑曼不動桿菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥性進行分析，探討鮑曼不動桿菌主動外排泵基因adeB在其耐藥機制中的作用，報道如下。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 本實驗所用菌株來自2012-2013年河北醫科大學第一醫院不重復菌株96株，其中來自下呼吸道標本76株，尿道分泌物標本11株，血液標本4株，尿液標本3株，炎性分泌物標本2株。進行純培養后，經法國梅里埃公司Vitek32全自動微生物檢測儀鑒定為鮑曼不動桿菌。

1.2 試劑 藥敏紙片：頭孢他啶(CAZ，每片30 μg)、 頭孢哌酮/舒巴坦(SCF，每片75或10 μg)、頭孢噻肟(CTX，每片30 μg)、頭孢吡肟(CPR，每片30 μg)、頭孢曲松(CRO，每片30 μg)、氨芐西林(AMP，每片10 μg)、哌拉西林(PIP，每片100 μg)、氨芐西林/舒巴坦(SAM，每片各10 μg)、哌拉西林/他唑巴坦(TZP，每片100/10 μg)。K-B法藥敏紙片均為英國OXID公司產品。

AST-GN 藥敏卡和GN鑒定卡(法國生物梅里埃公司產品)，泵抑制劑羰基氰氯苯腙(carbonyl cyanide chlorobenzene hydrazone，CCCP)和泵抑制劑溶解試劑二甲亞砜(河北博世林公司)，引物合成 adeB(委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成)，DNA提取 Maxwell?16 Cell LEV DNA Purification Kit 試劑盒(Promega公司)，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)擴增 GoTaq?Green Master Mix、GoTaq?Colorless Master Mix(美國Promega公司)，DNA染色劑 Goldview，DNA Ladder Marker(北京賽百盛公司)，瓊脂糖X-gal(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.3 儀器 MaxweII-16核酸提取儀(美國Promega公司)；Mini-4K/6K 微型離心機(珠海黑馬醫學儀器有限公司)；AB 9700PCR擴增儀(美國AB公司)；DYY-12電泳儀(北京六一儀器廠)；VilBer LouRMAT凝膠成像系統(法國VILBER LOURMAT公司)；SIGMA 3-18K臺式冷凍離心機(德國Sigma公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥敏實驗 按照2012年M02-A11臨床實驗室標準研究所(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)推薦的Kirby-Bauer法，對CAZ、SCF、CTX、CPR、CRO、AMP、PIP、SAM、TZP進行藥敏實驗。

1.4.2 外排泵表型陽性鮑曼不動桿菌的判定 參考Sylvia Valdezate方法，比較應用CCCP前后，96株多重耐藥鮑曼不動桿菌對抗菌藥物最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的變化，以加入泵抑制劑后MIC值比不加泵抑制劑降低至≤1/4作為外排泵表型陽性的判定標準。

1.4.3 外排泵蛋白基因adeB的檢測 采用PCR技術檢測外排泵蛋白基因adeB。adeB基因PCR引物的設計：根據GenBanK中已發布的各型基因序列[1]，自行設計基因引物，擴增產物長度約541 bp，委托上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

引物A：5′-TTAACGATAGCGTTGTAACC-3′(貨號：AF370885)，引物B：5′-TGAGCAGACAATGGAATAGT-3′(貨號：AF370885)。

1.4.4 電泳 緩沖液0.5×TBE，電壓100 V。上樣標本量8 μL，DNA分子量Maker(100 bp)8 μL，電泳50 min置于全自動凝膠圖像成像儀上觀察結果并攝像，出現與目的基因片段分子相當的條帶判為陽性。

1.4.5 adeB基因測序 將PCR擴增產物和切下的含陽性DNA的凝膠送至上海生工生物工程技術服務有限公司進行核苷酸序列測定。

2 結果

2.1 96株鮑曼不動桿菌對9種β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥情況 見表1。

表1 96株鮑曼不動桿菌對9種β-內酰胺類抗菌藥物的耐藥情況

2.2 96株多重耐藥鮑曼不動桿菌對9種β-內酰胺類抗菌藥物MIC的變化 加入泵抑制劑CCCP后，MIC值比不加泵抑制劑降低至≤1/4作為外排泵表型陽性的判定標準，篩選出外排泵表型陽性菌34株。

2.3 adeB基因的檢出情況 34株鮑曼不動桿菌檢測到adeB基因的有33株，檢出率為97.06%。

2.4 adeB基因測序結果 取正反向雙向測序結果一致的序列作為參比序列，應用NCBI中BLAST程序比對序列。adeB基因測序結果見圖1。

2.5 基因序列比對 經比對所測序列與Genebank中序列同源性均為100.0%，未發現基因變異現象。

3 討論

鮑曼不動桿菌基因組研究發現，其具有快速獲得和傳播耐藥性的能力，多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥鮑曼不動桿菌呈世界性流行趨勢，是目前我國最重要的“超級細菌”，也對全球抗感染領域提出挑戰。由于鮑曼不動桿菌經常可以從各類標本中分離出來，所以成為引起院內感染的最為重要的機會致病菌。鮑曼不動桿菌通過酶機制、外排泵、抗滲性等極容易形成耐藥菌株[2]。主動外排泵由菌體細胞膜表面蛋白組成，可以將進入細菌體內的藥物排到細胞外，外排泵的過度表達可以引起鮑曼不動桿菌耐藥性改變[3]。adeABC外排泵系統是引起鮑曼不動桿菌多重耐藥的重要因素[4]。

筆者選取常用的3種第3代頭孢菌素(頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲松)和1種第4代頭孢菌素(頭孢吡肟)，結果顯示第4代頭孢菌素的耐藥率較第3代頭孢菌素的耐藥率略低，但鮑曼不動桿菌對4種頭孢菌素的耐藥率均較高，提示臨床醫生在針對鮑曼不動桿菌感染時，一定要根據藥敏實驗結果選擇抗菌藥物。依據《中國鮑曼不動桿菌感染診治與防控專家共識》中制定的鮑曼不動桿菌感染的抗菌治療原則，選用含β-內酰胺酶抑制藥舒巴坦、他唑巴坦的復合制劑，如氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦等，對于嚴重感染者可根據藥敏結果與米諾環素、阿米卡星等藥物聯合使用。目前，國內鮑曼不動桿菌感染單用β-內酰胺類抗菌藥物已顯無效。

當鮑曼不動桿菌攜帶轉座子介導的bla(TEM-2)或攜帶AmpC酶時，都會引起菌株對青霉素類藥物的耐藥，而選用含β-內酰胺酶抑制劑舒巴坦、他唑巴坦的復合制劑，如氨芐西林/舒巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦和哌拉西林/他唑巴坦時，其耐藥率也較高，表明鮑曼不動桿菌對含酶抑制劑的抗菌藥物仍表達為耐藥，臨床治療效果難以保證，這也顯示外排泵基因的高度表達，可將進入細胞內的抗菌藥物主動泵出可能是其耐藥的重要因素，而不是β-內酰胺酶。

本實驗篩選出34株鮑曼不動桿菌，在加入CCCP后，9種抗菌藥物MIC值均明顯降低；34株鮑曼不動桿菌可能由于外排泵的存在而產生耐藥，說明CCCP對逆轉鮑曼不動桿菌耐藥行之有效。

主動外排機制使藥物非特異性排出，導致多重耐藥鮑曼不動桿菌的出現。AdeABC外排泵是鮑曼不動桿菌最主要的外排系統。AdeABC外排泵由在染色體上按順序排列的結構基因adeA、adeB、adeC編碼的膜融合蛋白AdeA、外排蛋白AdeB、外膜通道蛋白AdeC形成的三聯體組成[5]。約80%的鮑曼不動桿菌含有adeABC操縱子，從而控制adeABC的過度表達，降低喹諾酮類、β-內酰胺類、氨基苷類藥物的敏感性[6]。于翠香等[7]也認為，多重耐藥鮑曼不動桿菌攜帶外排泵基因，可能是這些菌株高耐藥原因之一。

本研究通過對34株外排泵表型陽性鮑曼不動桿菌進行AdeABC外排泵的跨膜組件AdeB基因測定，檢測到adeB基因有33株，檢出陽性率較高，表明主動外排泵基因是多重耐藥鮑曼不動桿菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的一個重要因素。取正反向測序結果一致的序列作為參比序列，應用NCBI中BLAST程序比對序列，經比對所測序列與Genebank中序列同源性均為100.0%，未發現基因變異現象。表明AdeABC外排泵機制在鮑曼不動桿菌對抗菌藥物的敏感性尤其重要。含有adeB基底泵的重組衍生體，相對于不含adeB基底泵抗菌藥物的敏感性降低。此外，結構基因的失活，尤其是編碼轉錄蛋白的adeB，外排泵活性的增強以及不同的外排泵之間相互作用，外排泵抑制劑在鮑曼不動桿菌對不同抗菌藥物耐藥性逆轉中的應用仍有待研究。

本實驗研究了β-內酰胺類抗菌藥物作用于多重耐藥鮑曼不動桿菌的靶位、細菌產生耐藥性的因素及耐藥機制，可為做好預防細菌產生耐藥性、提高臨床β-內酰胺類抗菌藥物使用效率提供參考，同時為研制開發新的抗菌藥物提供參考。

[1]HOU P F，CHEN X Y，YAN G F，et al.Study of the correlation of imipenem resistance with efflux pumps AdeABC，AdeIJK，AdeDE and AbeM in clinical isolates ofAcinetobacterbaumannii[J].Chemother，2012，58(2)：152-158.

[2] 宋彩虹，陸水英，張秀瑜，等.鮑曼不動桿菌臨床分離株的耐藥性及同源性分析[J].中國微生態學雜志，2013，25(2)：161-164.

[3] 佘婷婷，沈繼錄，徐元宏，等.泛耐藥鮑曼不動桿菌耐碳青霉烯類抗菌藥物機制研究[J].安徽醫科大學學報，2012，47(3)：274-278.

[4] 王瑋瑋，王厚照，張玲.adeABC 基因對鮑曼不動桿菌耐藥性的影響[J].國際檢驗醫學雜志，2013，34(9)：1069-1070.

[5] 劉嘉，申恒巧，劉漢清.鮑曼不動桿菌的多重耐藥性與主動外排系統[J].醫藥導報，2011，30(9)：1191-1193.

[6] COYNE S，GUIGON G，COURVALIN P，et al.Screening and quantification of the expression of antibiotic resistance genes inAcinetobacterbaumanniiwith a microarray[J].Antimicrob Agents Chemother，2010，54(1)：333-340.

[7] 于翠香，傅愛玲，王英田，等.多重耐藥鮑曼不動桿菌抗菌制劑外排泵基因研究[J].中國抗生素雜志，2013，38(8)：629-632.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.009

Effects of the Active Efflux Gene on Multidrug Resistance ofAcinetobacterBaumanniito Beta Lactam Antibiotics

SUN Jingna1,YANG Jizhang2,WANG Guoxin1,ZHAO Shuai1,LIU Zeshi1,ZHANG Zheng1

(1.ClinicalLaboratory;2.DepartmentofPharmacy，theFirstHospitalofHebeiMedicalUniversity,Shijiazhuang050031，China)

Objective To investigate the effect of expression of active efflux gene on multidrug resistantAcinetobacterbaumanniiin the course of resistance to beta lactam antibiotics. Methods Drug resistance of 96 strains of multidrug resistantAcinetobacterbaumanniito nine beta lactam antibiotics was analyzed.A total of 34 efflux phenotype positive strains were isolated according to the standard that the MIC level was reduced by more than 75 percent when the carbonyl cyanide chlorobenzene hydrazone inhibitors were added.The efflux pump protein gene adeB was detected, analyzed and sequenced by the method of PCR amplification. Results The antibiotic resistance rate to cefotaxime, cefiazidime，ceftriaxone，cefepime, cefperazone/sulbactam were 92.3%，86.6%，83.0%，70.8%，68.3%, respectively.The resistance rate to ampicillin, piperacillin, piperacillin/tazobactam and ampicillin/sulbactamare were 90.1%, 77.5%, 72.4%，67.3%, respectively.The adeB genes were detected in 33 stains out of 34 of the efflux pump phenotype positive strains, and the positive rate was 97.06%.The 33 strains were sequenced for adeB efflux pump gene.We found the sequence homology was 100.0% match with Genebank. Conclusion Active efflux pump gene inAcinetobacterbaumanniiplays an important role in multidrug resistance to beta lactam antibiotics.

Acinetobacterbaumannii; Multidrug resistance; Efflux pump；Beta lactamase

2014-05-06

2014-06-02

*河北省科技廳科技支撐計劃基金資助項目(112061178D)

孫靜娜(1976-)，女，河北保定人，副主任檢驗師，碩士，主要從事微生物學研究。電話：0311-85917323，E-mail：787164547@qq.com。

楊繼章(1957-)，男，河北邢臺人，主任藥師，教授，碩士生導師，主要從事臨床藥理學研究。電話：0311-85917352，E-mail：yjzh1957@163.com。

R978.11；R965

A

1004-0781(2015)01-0040-04