葡萄籽原花青素對慢性間歇性低氧大鼠空間工作記憶和5-羥色胺的影響*

劉文倩，趙雅寧，李建民

(河北聯合大學康復醫學院，唐山 063000)

葡萄籽原花青素對慢性間歇性低氧大鼠空間工作記憶和5-羥色胺的影響*

劉文倩，趙雅寧，李建民

(河北聯合大學康復醫學院，唐山 063000)

目的 探討葡萄籽原花青素(GSPE)對慢性間歇性大鼠空間工作記憶和5-羥色胺(5-HT)的影響。方法 健康雄性SD大鼠80只，隨機分為正常對照組、模型對照組、GSPE小劑量組(100 mg·kg-1)和GSPE大劑量組(200 mg·kg-1)，每組20只。正常對照組暴露于空氣中，模型對照組和GSPE小、大劑量組暴露于低氧(50 mL·L-1)條件下，暴露時間每天8 h，持續6周；Morris水迷宮檢測大鼠的空間記憶能力；應用蘇木精-伊紅染色觀察腦組織形態變化；用高效液相色譜法測定大腦皮質內5-HT的含量。結果 與正常對照組比較，模型對照組水迷宮測試結果顯示大鼠潛伏期明顯延長，穿臺次數明顯減少；皮質區存活神經細胞數量減少，5-HT含量明顯降低(P<0.05)。與模型對照組比較，GSPE小、大劑量組水迷宮檢測大鼠逃避潛伏期時間縮短、穿臺次數增多，皮質區存活神經細胞數量增多，5-HT含量明顯增多(P<0.05)；上述變化在GSPE大劑量組更為顯著(P<0.05)。結論 GSPE可增加5-HT含量，改善間歇性低氧大鼠空間工作記憶能力。

葡萄籽原花青素；低氧，間歇性；5-羥色胺；記憶

阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征(obstructive sleep apnea-hypopnea syndrome，OSAHS) 可造成患者記憶障礙，并出現執行能力和運動協調方面的認知問題[1-2]。5-羥色胺(5-hydroxytryptamine，5-HT)是腦內重要的神經遞質，與許多功能調節有關，如睡眠、性行為、情感行為以及學習和記憶等[3]。原花青素是天然植物中廣泛存在的一大類多酚類化合物的總稱，以葡萄籽中含量最為豐富。研究表明，葡萄籽原花青素(grape seed proanthocyanidin extract，GSPE)具有抗氧化、清除自由基、心血管保護、降血脂、抗腫瘤等功能[4-5]，但目前有關GSPE對睡眠呼吸暫停及工作記憶影響研究少見報道。筆者采用濃度結合時間切換的方式模擬臨床睡眠呼吸暫停狀態的低氧，建立慢性間歇性低氧模型，探討GSPE對間歇性低氧大鼠空間記憶與5-HT的影響。

1 材料與方法

1.1 動物、試劑及儀器 清潔級雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠80只(中國醫學科學院實驗動物研究所動物資源中心提供，生產許可證號：中科動管第003號，動物使用合格證號：0127011)，體質量210～230 g，飼養于河北聯合大學動物實驗中心，實驗室環境：溫度22～26 ℃，相對濕度40%～70%；測氧儀(建德市梅城電化分析儀器廠)；低氧控制程序(河北聯合大學醫院呼吸科)；純氮(唐山六方氣體高科技有限公司)；低氧艙(天津醫科大學研制)。GSPE由天津市尖峰天然產物研究開發有限公司提供(純度95%，批號：20060705)。

1.2 動物分組與模型制備 雄性SD大鼠80只，采用抽簽法隨機分成正常對照組、模型對照組，GSPE大、小劑量組，各組動物20只。正常對照組：向艙內循環注入壓縮空氣30 s，流速3 L·min-1；空氣90 s流速3 L·min-1，氧濃度維持在21%；模型對照組：模擬臨床呼吸暫停事件，每天8：00～16：00將實驗動物置于模型艙內，向艙內循環充入氮氣30 s，流速為10 L·min-1，空氣40 s，流速為10 L·min-1(復氧時間)，空氣50 s流速為5 L·min-1(常氧維持時間)，每2 min為1個循環，使得艙內氧濃度在5%～21%間循環[6]，每天實驗8 h，持續時間為6周。干預組在動物進入低氧模型艙前2周開始每天灌胃給藥1次，持續給藥6周，GSPE大、小劑量分別為200，100 mg·kg-1。用數字測氧儀監測艙內氧濃度變化，使艙內氧濃度維持在各自的氧濃度內，使其氧濃度波動范圍在±0.5%以內。

模型對照組抽簽法隨機取大鼠2只，分別在連續12個低氧暴露周期內不同時間點采血。以剛開始充入氮氣作為零時間采血點，實驗分析第一個時間點應該是大鼠體內血氧分壓開始下降點。依次在下一個周期內采血，每個采血點都較前一個采血周期點推后10 s，一個周期內2 min，正好為12個采血時間點，采取的動脈血在10 min內送至血氣分析室測定，記錄大鼠動脈血氣氧分壓、二氧化碳分壓之間的變化情況，以判斷模型是否成功。

1.3 記憶功能檢測 采用Morris水迷宮檢測。實驗時，將安全島置于水迷宮第二象限中，加水至高過安全島2～3 cm，水溫保持在22～25 ℃，由攝像機及計算機自動跟蹤、攝相和統計大鼠分別由四個象限入水后尋找到安全島的軌跡、潛伏值和穿臺次數。如在90 s內未找到安全島，則潛伏期值記為90 s。在規定時間點處死前晨起訓練5次后，分別在上午、下午各測試3次，共6次納入統計，記錄各組大鼠逃避潛伏期時間及撤去平臺后穿越原平臺位置的次數，取總均值。

1.4 腦組織形態結構觀察及病理組織學檢測 動物用4%多聚甲醛灌注固定后取腦，截取視交叉平面至大腦橫裂腦組織，常規石蠟包埋。Leica石蠟切片機連續冠狀切片，片厚5 μm，蘇木精-伊紅染色。在有測微尺的光學顯微鏡(200倍)下觀察額葉皮質區神經細胞形態變化并計數該視野下的存活神經細胞數量(有明顯細胞膜、細胞核、核仁為存活神經細胞)。具體方法：將每個標本取4張切片，在額葉皮質區隨機選取視野4個，在有測微尺的光學顯微鏡(200倍)下觀察額葉皮質區陽性細胞變化并計數，以每個視野下平均細胞百分率(皮質區存活細胞數量與總細胞數量比值/%)表示。

1.5 高效液相色譜(HPLC)法檢測腦內5-HT HPLC Column C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，保護柱DIKMA(4 mm×8 mm，5 μm)。柱溫20 ℃，流動相選用檸檬酸、檸檬酸三鈉、甲醇-離子對試劑-依地酸二鈉混合液(pH4.2)，經孔徑0.22 μm的濾膜過濾后使用，梯度洗脫：0～5 min 97.5%A；～12 min 97.5%→88.0%A；12～16 min 85.0%A；～30 min 85.0%A；～35 min 85.0%→97.5% A。流速1.0 mL·min-1。檢測器設定電壓為350 mV。取凍存大鼠腦皮層準確稱質量，用預冷的高氯酸(內含0.15 μg·mL-12，3-二羥基甲酸)制備10%的組織勻漿，離心15 min，上清液經孔徑0.22 μm的濾膜過濾后取10 μL自動進樣，在上述色譜條件下，采用內標法測定5-HT含量，以ng·g-1腦組織濕質量表示，樣本處理液：0.01%半胱氨酸加0.2 mol·L-1高氯酸鈉加0.5 mmol·L-1依地酸。標準液配制：0.1 mol·L-1制備成0.35 mg·mL-1對照品儲存液，按上述色譜條件下處理。

2 結果

2.1 GSPE對慢性間歇性低氧大鼠空間記憶能力的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠逃避潛伏期時間均延長，穿越原平臺位置的次數均減少；與模型對照組比較，GSPE組大鼠逃避潛伏期時間顯著縮短，穿越原平臺位置的次數明顯增加(P<0.05)。見圖1和表1。

與正常對照組同時間點比較，*1P<0.05；與模型對照組同時間點比較，*2P<0.05；與GSPE小劑量組同時間點比較，*3P<0.05

Compared with normal control group at the same time point，*1P<0.05；compared with model control group at the same time point，*2P<0.05；compared with low-dose GSPE group at the same time point，*3P<0.05

2.2 GSPE對慢性間歇性低氧大鼠皮質區神經細胞形態結構的影響 正常對照組大鼠大腦皮層結構完整，細胞排列整齊。模型對照組大鼠在間歇性低氧2，6周均可見變性壞死神經細胞，胞體收縮呈三角形，細胞質嗜色性減弱，核皺縮濃染，細胞周圍出現空隙；視野內可見核溶解及神經細胞空泡樣變，細胞間隙顯著增寬，存活神經細胞均明顯減少(P<0.05)；GSPE組中皮質區神經細胞結構損傷減輕，大部分細胞結構完整，存活神經細胞顯著增多(P<0.05)，見圖2。

2.3 GSPE對慢性間歇性低氧腦組織5-HT含量的影響 與正常對照組比較，模型對照組大鼠腦皮質中5-HT含量顯著降低，差異有統計學意義(P<0.05)。與模型對照組比較，GSPE組中腦組織5-HT含量都有不同程度升高(P<0.05)。見表2。

3 討論

工作記憶包括負責加工位置、距離等空間信息的視空間模板和處理語音方面的信息語音環路以及中央執行系統，其核心系統位于前額葉[7]。神經影像學顯示OSAHS患者大腦的多個部位和功能區受損如大腦皮質灰質丟失、含海馬區在內的腦實質萎縮等；應用事件相關電位評測睡眠呼吸暫停患者，發現反映信息加工的事件電位N270電位(前額及枕部)波幅降低，患者工作記憶降低[8]。筆者在本研究利用水迷宮評測動物記憶行為，其中逃避潛伏期反映大鼠尋找平臺位置的能力，即有效獲取及有效處理信息的能力；穿越原平臺位置次數反映記憶的保持能力。結果顯示GSPE可改善OSAHS低氧導致的工作記憶損傷。研究認為OSAHS造成的間歇性低氧類似于缺血-再灌注，可造成腦內生成大量氧自由基，導致神經細胞結構損傷、丟失，引起記憶功能損害[9]；而GSPE抗氧化能力極強，是維生素E的50倍、維生素C的20倍，與超氧化物歧化酶相當[10]，因此可改善睡眠呼吸暫停大鼠記憶能力，能增強其信息的獲取、加工及保持能力。

表2 4組大鼠皮質區存活神經細胞密度和5-HT含量比較

Tab.2 Comparison of the density of viable nerve cell and 5-HT content in cortex among four groups of rats

與正常對照組同時間點比較，*1P<0.05；與模型對照組同時間點比較，*2P<0.05；與GSPE小劑量組同時間點比較，*3P<0.05

Compared with normal control group at the same time point，*1P<0.05；compared with model control group at the same time point，*2P<0.05；compared with low-dose GSPE group at the same time point，*3P<0.05

5-HT是腦內存在的一種重要的神經遞質，對記憶的調節以及腦功能的維持有重要作用。MAZER等[11]給成年大鼠腦中灌注酪氨酸羥化酶抑制劑對氯苯丙氨酸以耗竭5-HT，結果出現大鼠學習能力缺損。學習記憶能力下降的大鼠其腦內5-HT亦顯著降低[12]。研究發現迷迭香對血管性癡呆大鼠學習記憶功能有改善作用，且這種作用與腦內5-HT的改變有關[13]。睡眠呼吸暫?；颊唧w內5-HT水平發生變化，且這種變化與病情的嚴重程度相關[14]。本研究結果顯示，隨間歇性低氧時間的延長，大鼠腦內5-HT的含量降低，說明5-HT參與OSAHS模式間歇性低氧對中樞神經系統的病理進程。睡眠OSAHS模式的間歇低氧造成的反復低氧后再復氧，可引起神經細胞能量代謝障礙、氧自由基損傷，導致單胺類神經遞質5-HT等合成、攝取和釋放紊亂，腦實質神經細胞內5-HT含量降低[15]。本研究中，給予GSPE干預后，模型大鼠腦內5-HT含量明顯改善，其表達水平呈劑量依賴性顯著增加，說明GSPE對睡眠呼吸暫停間歇性低氧大鼠腦內5-HT水平有一定調節作用。這可能是GSPE改善OSAHS致工作記憶損傷的機制之一。

總之，本實驗結果表明，GSPE可調節OSAHS模式低氧大鼠腦內5-HT水平，減輕睡眠OSAHS模式低氧大鼠空間工作記憶能力。鑒于GSPE具有多種藥理活性，其改善OSAHS神經損傷及調控5-HT的機制有待進一步探討。

[1] 潘志杰，劉微波，周建英，等.阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征老年患者的認知功能評價[J].中華結核和呼吸雜志，2005，28(6)：411-413

[2] BEEBE D W，GROESZ L，WELLS C，et al.The neuropsy-chological effects of obstructive sleep panea：a meta-analysis of norm-referenced and case-controlled data [J].Sleep，2003，26(3)：298-307.

[3] 李娟娟，郭澤云，于建云.腦損傷后5-HT能神經變化與認知障礙的研究進展[J].神經解剖學雜志，2007，23(4)：441-444.

[4] 吳嵐，劉開祥，俸軍林，等.原花青素對腦缺血-再灌注損傷大鼠血腦屏障通透性和自由基含量的影響[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2009，7(7)：801-803.

[5]FENG Y，LIU Y M，LEBLANC M H，et al.Grape seed extract given three hours after injury suppresses lipid peroxidation and reduces hypoxia-ischemic brain injury in neonatal rats[J].Pediatr Res，2007，61(3)：295-300.

[6] 王紅陽，郭霞，趙雅寧，等.大鼠慢性間歇性低氧后氧自由基/JNK信號通路介導神經損傷的機制[J].中國臨床解剖學雜志，2013，31(1)：75-80.

[7]COURTNEY S M,UNGEDEIDER L G,KEIL K,et al.Object and spatial visual working memory activate separate neural systems in human cortex[J].Cereb Cortex，1996，6(1)：3949-3953.

[8] 張熙，王玉平，李舜偉，等.阻塞性睡眠呼吸暫停綜合征夜間間斷性低血氧對早期工作記憶損害的事件相關電位[J].中國藥理學與毒理學雜志，2001，15(6)：427-433.

[9]SVATIKOVA A，WORK R，LERMANLO，et al.Oxidative stressing obstructive sleep apnea [J].Eur Heart，2005，26(22)：2435-2439.

[10] 李春陽，許時嬰，王璋，等.DPPH法測定葡萄籽原花青素清除自由基的能力 [J].食品與生物技術學報，2006，25(2)：102-106.

[11] MAZER C，MUNEYYIRCI J，TAHENY K，et al.Serotonin depletion during synaptogenesis leads to decreased synaptic density and learning deficits in the adult rat：a possible model of neuro-developmental disorders with cognitive deficits [J].Brain Res，1997，760(1)：68-73.

[12] 李訓軍，嚴家川，潘峰，等.REM睡眠剝奪對大鼠額葉皮質5-HT的含量及學習記憶的影響[J].重慶醫學，2009，38(10)：1151-1154.

[13] 云龍，高曉平，李光武.迷迭香吸嗅對血管性癡呆大鼠學習記憶及海馬內5-羥色胺含量的影響[J].中國康復醫學，2013，28(7)：657-659.

[14] 王晶華，劉攀，黃民.5-羥色胺與阻塞性睡眠呼吸暫停低通氣綜合征的關系[J].中華結核和呼吸雜志，2006，29(12)：795-796.

[15] 鐘益玨，張成，王廣發.5-羥色胺2受體激動劑及拮抗劑對大鼠睡眠呼吸暫停的影響[J].中華結核和呼吸雜志，2010，33(5)：350-353.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.003

Effects of Grape Seed Proanthocyanidin Extract on Spatial Working Memory and 5-Hydroxytryptamine in the Rat Model of Intermittent Hypoxia

LIU Wenqian,ZHAO Yaning,LI Jianmin

(NursingandRehabilitationCollegeofHebeiUnitedUniversity,Tangshan063000,China)

Objective To investigate the effects of grape seed proanthocyanidin extract (GSPE) on 5-hydroxytryptamine (5-HT) and spatial working memory after intermittent hypoxia in rats. Methods Eighty male Sprague Dawley (SD) rats were divided randomly into four groups (n=20 in each group)：the normal control, model control, GSPEs at small (100 mg·kg-1) and high (200 mg·kg-1) dose groups.Rats in the normal control group were exposed in air and the model controls suffered from intermittent hypoxia (50 mL·L-1, 8 hours daily for 6 weeks).The spatial memory ability of rats in each group was assessed with the Morris water maze (MWM).The morphological changes of neuronal cell were observed by HE staining.The concentration of 5-HT in brain was detected by high performance liquid chromatography. Results Compared with the normal control group, the MWM test showed that the latency was prolonged and the frequency of crossing the platform was higher than that in model control group (P<0.05).The survival cells and the concentration of 5-HT significantly decreased in the model control group (P<0.05).Compared with the model control group, MWM test showed that the escaping latency was shortened and the frequency of crossing the platform was increased in the GSPE treatment groups compared with the model control group (P<0.05).The above observations are more significant in GSPE high dose group that the low dose group.The survival cells and the concentration of 5-HT significantly increased in the GSPE treatment groups (P<0.05). Conclusion GSPE can regulate the concentration of 5-HT and improve learning memory function under intermittent hypoxia.

Grape seed proanthocyanidin extract; Hypoxia, intermittent; 5-Hydroxytryptamine; Memory

2013-12-11

2014-05-31

*河北省教育廳重點資助項目(ZH2012046)

劉文倩(1988-)，女，河北唐山人，碩士，從事神經外科工作。電話：0315-3726234，E-mail：liuwenqian1988@126.com。

李建民(1974-)，女，河北唐山人，教授，博士，從事腦損傷與腦保護研究工作。電話：0315-3726234，E-mail：zyning789@126.com。

R282.71；R285

A

1004-0781(2015)01-0011-05