脈血康膠囊對單側輸尿管梗阻大鼠MMP-2和TIMP-2表達的影響*

郭慶喜，蒲霞，陳凱鋒，曹靈，楊成萬，孫興旺

(1.瀘州醫學院病理教研室，瀘州 646000；2.解放軍第42醫院病理科，樂山 614100；3瀘州醫學院附屬醫院腎病內科，瀘州 646000)

·藥物研究·

脈血康膠囊對單側輸尿管梗阻大鼠MMP-2和TIMP-2表達的影響*

郭慶喜1，蒲霞1，陳凱鋒2，曹靈3，楊成萬1，孫興旺1

(1.瀘州醫學院病理教研室，瀘州 646000；2.解放軍第42醫院病理科，樂山 614100；3瀘州醫學院附屬醫院腎病內科，瀘州 646000)

目的 觀察脈血康膠囊對大鼠單側輸尿管梗阻性腎(UUO)組織中基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)和基質金屬蛋白酶組織抑制因子-2(TIMP-2)表達的影響，探討脈血康膠囊對腎間質纖維化的影響及其作用機制。方法 SD雄性大鼠96只，隨機分為正常對照組、假手術組、模型對照組及脈血康組，各24只。前3組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃，脈血康組于手術前3 d開始給予脈血康膠囊0.05 g·kg-1·d-1，以0.9%氯化鈉溶液2 mL稀釋灌胃，于造模后第1，4，7，14天每組隨機處死6只大鼠，觀察腎組織內MMP-2及TIMP-2表達。結果 模型對照組及脈血康組的MMP-2表達從第4天起逐漸減少，且脈血康組MMP-2表達高于模型對照組。TIMP-2的表達在模型對照組及脈血康組明顯增多，且脈血康組TIMP-2表達低于模型對照組。模型對照組及脈血康組MMP-2/TIMP-2較正常對照組及假手術組顯著降低；第14天，模型對照組和脈血康組MMP-2/TIMP-2分別為0.595±0.138，0.892±0.158，差異有統計學意義(P<0.05)。結論 脈血康膠囊可能通過上調MMP-2及下調TIMP-2來調節腎臟細胞外基質的代謝而抑制UUO大鼠腎間質纖維化。

脈血康膠囊；基質金屬蛋白酶；基質金屬蛋白酶組織抑制因子；腎間質纖維化

腎間質纖維化是各種慢性腎病進展到終末期的主要病理改變之一。細胞外基質(extracellular matrix，ECM)在腎間質中過度沉積是腎間質纖維化的主要特征。ECM主要由腎間質肌纖維母細胞(myofibroblast，MFB)合成[1]，基質金屬蛋白酶(matrix metallo-proteinases，MMPs)及金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitors of metaloproteinases，TIMPs)的活性異常與ECM沉積密切相關。臨床研究發現脈血康膠囊對慢性腎衰竭等具有較好的療效。筆者應用脈血康膠囊治療單側輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction，UUO)大鼠，動態觀察早期梗阻性腎病MMP-2及TIMP-2表達情況，探討脈血康膠囊對腎間質纖維化作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1 動物與試劑 普通級雄性斯潑累格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠，生產許可證號：SCXK(川)2008-1-7，使用許可證號：SYXK(川)2008-065，由瀘州醫學院實驗動物中心提供。動物飼養環境為每籠1只，室溫(22±2) ℃。脈血康膠囊購于重慶時珍閣普生藥業有限公司(批準文號：國藥準字Z10970056)。兔抗鼠MMP-2多克隆抗體、TIMP-2多克隆抗體購于北京博奧森生物公司，免疫組化即用型SP試劑盒購于福州邁新生物公司。

1.2 方法

1.2.1 大鼠UUO模型的制備及藥物處理 普通級雄性SD大鼠96只，周齡6～7周，體質量(180±20) g，隨機分為4組，正常對照組、假手術組、模型對照組、脈血康組，各24只。大鼠用2%戊巴比妥溶液50 mg·kg-1腹腔注射麻醉后，手術區局部剃毛，常規消毒鋪孔巾，選擇下腹正中線切口，經皮切開逐層進入腹腔，尋找膀胱，然后在膀胱頸處分離出右側輸尿管，4號絲線2次結扎右側輸尿管入膀胱段，然后逐層縫合關腹，制作大鼠UUO模型[2]。脈血康組和模型對照組均按上述步驟進行手術。假手術組手術入路方式同上，但不結扎輸尿管。正常對照組不進行手術。脈血康組手術前3 d及手術后給予脈血康膠囊0.05 g·kg-1·d-1(預實驗顯示該劑量效果較好)，以0.9%氯化鈉溶液2 mL稀釋灌胃；正常對照組、假手術組及模型對照組均給予同體積0.9%氯化鈉溶液灌胃。

1.2.2 標本采集 各組分別于第1，第4，第7，第14天按隨機編號選取大鼠6只，各用2%戊巴比妥溶液0.5 mL腹腔注射麻醉后，暴露心臟及雙側腎臟，用50 mL注射器抽吸4%甲醛溶液40 mL，從大鼠心臟加壓注入，對大鼠組織進行固定，小心分離出大鼠雙側腎臟，于腎門處剪斷腎蒂，對剖，置于盛有4%多聚甲醛的玻璃瓶中固定，待做病理及免疫組化檢測。

1.2.3 免疫組化及結果評定 大鼠腎臟經固定、脫水、包埋制成組織蠟塊，石蠟切片機切片，免疫組織化學染色采用strept avidin-biotin complex(SABC)法，染色步驟按MMP-2及TIMP-2試劑盒說明書進行。均設陽性對照及陰性對照。結果判定及半定量分析：采用真彩色病理圖像分析系統，通過顯微鏡攝取圖像，對圖像自動測量。每張切片隨機觀察不重疊的視野20個，計算陽性表達部位染色總面積與視野內腎小管間質總面積(去除腎血管、腎小球及腎小管管腔面積)，以兩者比值的平均值進行比較[3]。

2 結果

2.1 大鼠MMP-2動態表達 MMP-2主要在腎小管上皮細胞質中表達，呈棕黃色顆粒狀。脈血康組與正常對照組及假手術組比較，MMP-2表達減少，從第4天起差異有統計學意義(t=2.26,P<0.05)；與模型對照組比較，MMP-2表達略增加，第14天顯著增加(P<0.05)。(表1，圖1，2)。

2.2 大鼠TIMP-2動態表達 TIMP-2主要表達于腎小管上皮細胞細胞質，呈棕黃色顆粒狀。脈血康組隨梗阻時間延長TIMP-2表達逐漸增加，第7天起顯著增加(P<0.01)，各時間點表達較正常對照組及假手術組顯著增加(P<0.01)，較模型對照組表達降低，第7天起差異有統計學意義(P<0.05)(圖3，4，表2)。

2.3 MMP-2/TIMP-2結果 脈血康組MMP-2/TIMP-2逐漸下降，從第7天起差異有統計學意義(P<0.01)，與正常對照組及假手術組比較，各時間點均顯著降低(P<0.01)，與模型對照組比較，MMP-2/TIMP-2均升高，第14天差異有統計學意義(P<0.05)(表3)。

表1 4組大鼠腎小管上皮細胞MMP-2的動態表達

Tab.1 Dynamic expression of MMP-2 in renal tubule epithelial cell in four groups of rats

與正常對照組及假手術組相同時間點比較，*1P<0.05；與模型對照組相同時間點比較，*2P<0.05

Compared with the normal control group and the sham operation group at the same time point，*1P<0.05；compared with the model control group at the same time point，*2P<0.05

Fig.1 MMP-2 expression in model control group(SABC×400)

Fig.3 TIMP-2 expression in model control group(SABC×400)

Fig.2 MMP-2 expression inmaixuekanggroup(SABC×400)

Fig.4 TIMP-2 expression inmaixuekanggroup(SABC×400)

表2 4組大鼠腎小管上皮細胞TIMP-2的動態表達

Tab.2 Dynamic expression of TIMP-2 in renal tubule epithelial cell in four groups of rats

與正常對照組及假手術組相同時間點比較，t=11.427～40.335，*1P<0.01；與模型對照組相同時間點比較，t=3.929，5.811，*2P<0.05

Compared with normal control group and sham operation group at the same time point，t=11.427-40.335，*1P<0.01；compared with model control group at the same time point，t=3.929，5.811，*2P<0.05

表3 4組大鼠腎小管上皮細胞MMP-2/TIMP-2比較

Tab.3 Comparison of MMP-2/TIMP-2 in renal tubule epithelial cell in four groups of rats

與正常對照組及假手術組相同時間點比較，*1P<0.01；與本組第1天比較，*2P<0.05；與模型對照組相同時間點比較，t=3.476，*3P<0.01

Compared with normol control group and sham operation group at the same time point，*1P<0.01；compared with itself at the first day，*2P<0.05；compared with model control group at the same time point，t=3.476，*3P<0.01

3 討論

腎間質纖維化是由各種原發性或繼發性腎臟疾病導致的進行性腎單位破壞、間質成纖維細胞增生及ECM沉積的病理過程。研究發現，腎間質纖維化的發生、發展與ECM的過度沉積和ECM降解受到抑制密切相關[4]。因此，調控ECM代謝的因子在腎間質纖維化的發生、發展中起著重要作用。MMPs及其抑制劑(TIMPs)是重要的ECM調控系統，是腎臟內主要的基質降解體系。MMPs家族是一組依賴二價金屬陽離子的內肽酶，幾乎能降解除多糖以外的全部ECM成分。MMP-2是腎臟表達的主要MMPs家族成員，可降解多種ECM成分，如Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ型膠原及纖維連接蛋白等。研究發現，MMP-2基因敲除小鼠腎間質纖維化進程更快，程度更重[5]，MMP-2在腎間質纖維化進程中發揮著重要作用，是最主要的調控因子之一。TIMPs是一組內源性分泌蛋白，是MMPs的天然抑制物，可與MMPs酶原相結合阻止其活化，也可與活化的MMPs結合而抑制MMPs。生理狀態下，MMPs與其抑制物TIMPs保持相對平衡，使有活性的MMPs控制在一定范圍內。在病理狀態下，MMPs表達減少或活性下降，TIMPs表達增高，MMPs和TIMPs平衡破壞，即可導致ECM 的沉積。TIMP-2是TIMPs家族成員。筆者在本實驗觀察到隨著梗阻時間延長，MMP-2表達減低，TIMP-2表達升高，MMP-2/TIMP-2逐漸降低，促進ECM沉積，導致腎間質纖維化。YANG等[6]實驗證實在膀胱出口部分梗阻的患者中存在MMPs/TIMPs平衡破壞。也有研究證實腎組織內MMPs/TIMPs平衡破壞，尤其是TIMP-2的增多，使ECM降解減少，可促進腎間質纖維化形成[7]。上述結果均與本實驗結果一致。

臨床應用脈血康膠囊治療慢性腎衰竭患者具有一定的療效，但作用機制不清，本研究通過預實驗選定最佳劑量脈血康溶液灌胃治療UUO大鼠，研究脈血康膠囊抑制腎間質纖維化的可能作用途徑。脈血康膠囊主要成分是水蛭素，水蛭素是從動物藥水蛭中提取的一種酸性多肽類物質，具有抗凝與抗血栓形成、降低血壓和血脂、改善血流動力學和微循環等作用[8]。研究發現，脈血康膠囊可通過抑制血小板聚集，改善腎臟血液流變學，降血脂，消退動脈粥樣硬化斑塊和減少蛋白尿等途徑對腎臟起到保護作用[9]。還可能發揮抑制炎癥遞質凝血酶的效應，抑制甲基纖維素增生和抗ECM蓄積，從而達到對抗慢性腎病腎小球硬化的作用[10]。但有關脈血康膠囊對UUO腎臟保護作用的研究還鮮見報道。本實驗結果顯示，脈血康膠囊可通過增加MMP-2表達，抑制TIMP-2表達，促進ECM的降解，從而延緩腎間質纖維化。由此推測，脈血康膠囊能夠通過影響腎臟基質金屬蛋白酶系統，減少ECM的沉積，延緩腎間質纖維化的進程。

[1] MERAN S,STEADMAN R.Fibroblasts and myofibroblasts in renal fibrosis [J].Int J Exp Path,2011,92(3):158-167.

[2] 薛痕，樊均明，陳亮，等.大鼠腎小管-間質纖維化動物模型[J].四川動物，2004，23(1)：16-20.

[3] 張翠薇，謝茂，張旭，等.威靈仙對單側輸尿管梗阻模型大鼠血液流變學及腎間質纖維化的影響[J].實用醫學雜志，2012，18(12)：3022-3024.

[4] LIU Y.Cellular and molecular mechanisms of renal fibrosis [J].Nat Rev Nephrol，2011,7(12)：684-696.

[5] TAKAMIYA Y,FUKAMI K,YAMAGISHI S,et al.Experi-mental diabetic nephropathy is accelerated in matrix metalloproteinase-2 knockout mice [J].Nephrol Dial Transplant,2013,28(1):55-62.

[6] YANG L,LIU R,WANG X,et al.Imbalance between matrix metalloproteinase-1(MMP-1) and tissue inhibitor of metalloproteinase-1(TIMP-1) contributes to bladder compliance changes in rabbits with partial bladder outlet obstruction(PBOO) [J].BJU Int,2013,112(4):391-397.

[7] YAN Q,SUI W,WANG B,et al.Expression of MMP-2 and TIMP-2 in renal tissue of patients with chronic active antibody-mediated renal graft rejection[J].Diagn Pathol,2012,137(1):141-144.

[8] 嚴永興，梁麗貞，沈詠慧，等.脈血康膠囊對腦梗死恢復期患者療效及對凝血功能的影響[J].中國中藥雜志,2012,37(23):3667-3668.

[9] 朱俊江.疏血通治療2型糖尿病腎病的療效觀察[J].臨床合理用藥，2012，5(4C)：75-76.

[10] 陳沙沙，任現志.黃芪、水蛭在慢性腎臟病治療中的作用[J].遼寧中醫藥大學學報，2012，10(1)：55-57.

DOI 10.3870/yydb.2015.01.001

Dynamic Observation ofMaixuekangCapsule on the Expression of MMP-2 and TIMP-2 in Rats with Unilateral Ureteral Obstruction

GUO Qingxi1, PU Xia1, CHEN Kaifeng2, CAO Ling3, YANG Chengwan1, SUN Xingwang1

(1.DepartmentofPathology,LuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China; 2.DepartmentofPathology,thePeople’sLiberationArmy42Hospital,Leshan614100,China; 3.DepartmentofNephrology,AffiliatedHospitaltoLuzhouMedicalCollege,Luzhou646000,China)

Objective To study the effect ofmaixuekangcaspsule on the expression of matrix metalloproteinases-2 (MMP-2) and tissue inhibitors of metaloproteinases-2 (TIMP-2) in the occlusion kidney dynamically by unilateral ureteral obstruction (UUO) in rats, and to investigate the effect and the mechanism ofmaixuekangcaspsule on the renal interstitial fibrosis (RIF). Methods The model rats were induced by ligating the right ureter.Ninety-six male Sprague Dawley (SD) rats were randomly divided into normal control group, sham-surgery group, model control group andmaixuekanggroup (0.05 g·kg-1·d-1by gastric gavage started 3 days prior to operation).Rats were sacrificed on the 1th, 4th, 7th and 14th day after UUO was initiated.The immunohistochemical technique and image analysis technique were performed to examine the expression of MMP-2 and TIMP-2 in each group. Results On day 4 after UUO, the expression of MMP-2 decreased in both model control andmaixuekanggroups, but the expression was significantly higher inmaixuekanggroup compared with the model control group (P<0.05).The expression of TIMP-2 was raised in both model control andmaixuekanggroups, but the expression was significantly lower inmaixuekanggroup compared with the model control group (P<0.05).On day 14 after UUO, the MMP-2/TIMP-2 ratio decreased in both model control andmaixuekanggroups, but the ratio inmaixuekanggroup (0.892±0.158) was significantly higher than the model control group (0.595±0.138,P<0.05). ConclusionMaixuekangcaspsule regulates the metabolism of extracellular matrix to postpone the proceeding of RIF, by eliciting the expression of MMP-2 and down-regulating the expression of TIMP-2.

Maixuekangcaspsule; Matrix metalloproteinases; Tissue inhibitors of metaloproteinases; Renal interstitial fibrosis

2013-12-06

2014-03-01

*四川省科技廳重點項目(2010JY0080)；瀘州市科技局項目[瀘市科(2004)60]

郭慶喜(1977-)，男，四川眉山人，講師，碩士，研究方向：腎臟病理學和分子病理學。電話：0830-3161808 ，E-mail：gqx_77@163.com 。

孫興旺(1965-)，男，陜西臨潼人，教授，學士，研究方向：腎臟病理和分子病理。電話：0830-3161808，E-mail：lzsunxw@163.com。

R286；R285.5

A

1004-0781(2015)01-0003-04