正交試驗優化芹菜素鋁配合物的熒光光度法測定條件

彭文毫

（湛江衛生學校，廣東 湛江524037）

正交試驗優化芹菜素鋁配合物的熒光光度法測定條件

彭文毫

（湛江衛生學校，廣東 湛江524037）

目的優化芹菜素鋁配合物的熒光光度法測定條件。方法在單因素實驗的基礎上，利用正交試驗優化芹菜素鋁配合物熒光光度法測定的反應條件。結果芹菜素鋁配合物熒光光度法測定條件的最優組合為反應溫度25℃、溶液pH值6.5、反應時間10分鐘。芹菜素的加入量在2.0×10-5～3.2×10-4mol/L范圍內與芹菜素鋁配合物的熒光強度（ΔF）線性關系良好（R2=0.996 6）。結論本方法簡便、快速，是一種快捷測定芹菜素含量的好方法。

芹菜素；配合物；熒光光度法；正交試驗；測定條件

芹菜素（Apigenin）是黃酮類化合物，又稱芹黃素、芹菜苷元，廣泛存在于多種水果、蔬菜、豆類和茶葉中，尤以芹菜中含量為高，在一些藥用植物如車前子、絡石藤、水蔓青和毛葉藜蘆等中也有很高的含量。芹菜素的化學結構為5，7，4'-三羥基黃酮，為黃色針晶狀粉末，不溶于水，易溶于乙醇和二甲基亞砜。研究表明，芹菜素具有抗炎、抗凋亡［1］、抗氧化［2］、抗菌、抗病毒［3］以及調節內分泌［4］等多方面的生物學活性，同時還具有明顯的抗腫瘤作用［5-6］。目前測定芹菜素的方法主要有毛細管電泳法［7］、色譜法［8］及質譜分析法［9］等，稀有金屬分光光度法［10］也有報道，但本文選用鋁與芹菜素形成配合物，用熒光光度法測定，該方法簡單快速，且避免了貴重試劑的使用，是一種快捷測定芹菜素的好方法，現介紹如下。

1 材料與儀器

芹菜素（純度≥98%，南京廣潤生物制品有限公司），三氯化鋁、氫氧化鈉、無水乙醇等其余試劑為國產分析純。

F95S熒光分光光度計（上海分析儀器總廠）；AR323CN型電子天平（美國奧豪斯）；FE20 pH計（梅特勒-托利多）；DK-8D電熱恒溫水槽（上海齊欣）；600數顯三用恒溫水箱（常州澳華）。

2 實驗方法

2.1 實驗所需試劑的配置

2.1.1 90%乙醇溶液的配置準確量取無水乙醇溶液450m l，滴加NaOH溶液調節溶液pH值為規定值，加三蒸水定容至500m l。

2.1.2 芹菜素標準溶液的配置準確稱取0.27 g芹菜素，加入90%乙醇溶解、定容，配制成2.0×10-3mol/L的芹菜素標準溶液500ml。

2.1.3 三氯化鋁標準溶液的配置準確稱取0.134 g三氯化鋁，加入90%乙醇溶解、定容，配制成1.0×10-3mol/L的三氯化鋁標準溶液1 000m l。

2.2 芹菜素鋁配合物熒光光度法測定

取10ml具塞比色管，依次加入1ml芹菜素標準溶液和三氯化鋁標準液1m l，用90%乙醇稀釋至刻度，振蕩搖勻后避光放置一段時間，于1 cm比色皿，用激發波長365 nm，發射波長480 nm測量其熒光強度F和F0（空白實驗），計算ΔF=F-F0。

2.3 正交試驗優化芹菜素鋁配合物熒光光度法測定的條件

在單因素實驗基礎上，對實驗反應溫度、pH值和反應時間3個因素各設計3個水平進行L9（34）正交試驗（見表1），以熒光強度ΔF為評價指標，綜合審評后確定優化方案。

表1 正交試驗因素水平

3 結果

3.1 測定波長的選擇

本實驗研究發現，芹菜素和三氯化鋁在90%乙醇溶液中均無熒光現象，而芹菜素鋁配合物在激發波長（λex）365 nm，發射波長（λem）480～504 nm處有較強的熒光峰，因此本實驗選擇λex=365 nm，λem=490 nm為以下實驗的測定波長。

3.2 單因素實驗結果

3.2.1 溶液pH值對熒光測定的影響（見圖1）由圖1可知，當乙醇溶液pH值為6.5時，芹菜素鋁配合物的熒光強度最強，在溶液pH值較高或較低時，熒光均不穩定，熒光強度降低，且在pH值為8時，溶液出現輕微混濁，影響熒光測定，因此實驗選用乙醇溶液的pH值為6.5。

3.2.2 反應時間對熒光測定的影響（見圖2）由圖2可知，當待測液混合均勻，避光放置10分鐘后熒光強度達到最大值，且90分鐘內待測液熒光強度值基本趨于穩定。因此，本實驗選擇在待測液混合均勻避光放置10分鐘后測定其熒光強度。

3.2.3 溶液溫度對熒光測定的影響（見圖3）與文獻研究相似［11］，本實驗研究發現待測液混合均勻，避光靜置于25℃恒溫水浴中15分鐘后熒光強度達到最大值；溫度高于25℃時，隨著溫度升高熒光強度逐漸減??；當溫度低于25℃時，熒光強度隨著溫度降低而減小。

圖1 溶液pH值對熒光測定的影響

圖2 反應時間對熒光測定的影響

圖3 溶液溫度對熒光測定的影響

3.3 正交試驗結果

根據正交試驗結果（見表2～3）的數據可知，因素A（反應溫度）和因素B（pH值）對芹菜素鋁配合物的熒光強度（ΔF）影響較大（P＜0.05）；因素C（反應時間）對芹菜素鋁配合物的熒光強度（ΔF）影響不大，說明在待測液混合均勻避光放置10分鐘后，熒光強度（ΔF）基本趨于穩定。綜合各因素考慮，芹菜素鋁配合物熒光光度法測定條件的最優組合為反應溫度25℃、溶液pH值為6.5、反應時間為10分鐘。

3.4 熒光光度法測定芹菜素鋁配合物的線性關系

此外，本研究在優化實驗條件下發現，加入不同量的芹菜素標準溶液，按2.2實驗方法操作，芹菜素鋁配合物的熒光強度（ΔF）與芹菜素在2.0×10-5～3.2×10-4mol/L濃度范圍內呈線性關系，回歸方程為ΔF=1.4×106C+147.66，相關系數R2=0.996 6。

4 討論

本實驗以芹菜素和三氯化鋁為原料，在90%乙醇溶液中迅速混勻反應得芹菜素鋁配合物，從而改變芹菜素的熒光吸收特性。對芹菜素鋁配合物熒光光度法測定條件的優化發現，其配合物熒光光度法測定條件的最優組合為反應溫度25℃、溶液pH值6.5、反應時間為10分鐘，這從配合物的熒光強度值（ΔF）得到驗證。由極差分析可知，上述3種因素對配合物熒光光度法測定的影響從大到小依次為反應溫度＞溶液pH值＞反應時間。此外研究還發現，芹菜素的加入量在一定范圍內與芹菜素鋁配合物的熒光強度（ΔF）呈較好的線性關系。由此可見，芹菜素能與鋁離子在一定條件下形成穩定的熒光配合物，可應用熒光光度法進行檢測，據此形成的熒光光度法測定芹菜素含量的方法簡單、快捷，為后續對天然藥物成分芹菜素的開發利用提供了一種新的檢測方法。

表2 芹菜素鋁配合物熒光光度法測定條件的優化及正交試驗結果

表3 方差分析

［1］史婷婷，白建平，梁月琴，等.芹菜素對大鼠缺血/再灌注心肌細胞凋亡及相關蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表達的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27（5）：666-671.

［2］Abate A，Yang G，Wong R J，et al.Apigenin decreases heminmediated heme oxygenase induction［J］.Free Radic Biol，2005，39（6）：711-718.

［3］Liu A L，Liu B，Qin H L，et al.Anti-influenza virus activities of flavonoids from the medicinal plant Elsholtzia rugulosa［J］.Planta Med，2008，74（8）：847-851.

［4］張麗波，姜恩魁.芹菜素對雌性大鼠性周期的影響［J］.遼寧醫學院學報，2007，28（1）：13-14.

［5］胡太平，曹建國.芹菜素誘導人胃癌細胞凋亡作用及機制研究［J］.國際病理科學與臨床雜志，2007，27（1）：6-10.

［6］Saeed M，Kadioglu O，Khalid H，et al.Activity of the dietary flavonoid，apigenin，against multidrug-resistant tumor cells as determined by pharmacogenomics and molecular docking［J］.JNutr Biochem，2014（10）：13-17.

［7］高瑞斌，楊艷，董樹清，等.高效毛細管電泳同時測定大棗中環磷酸腺苷、芹菜素及槲皮素［J］.食品工業科技，2014，35（9）：282-285.

［8］王克勤，羅軍武，陳靜萍，等.高效液相色譜法測定芹菜中芹菜素含量［J］.食品與機械，2009，25（2）：74-77.

［9］焦燕，王英鋒，劉鎖蘭.LC-MS/MS法同時測定不同產地半枝蓮中野黃芩苷和芹菜素含量［J］.藥物分析雜志，2009，29（9）：1451-1453.

［10］陶蓮春.芹菜素衍生物的制備及活性研究［D］.蘭州：蘭州理工大學，2012.

［11］姚本林，時小波.槲皮素鋁的絡合反應及槲皮素的熒光光度測定［J］.理化檢驗，2002，38（4）：186-187.

G424.31

B

1671-1246（2015）18-0103-02