4周游泳訓(xùn)練對db/db小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞介導(dǎo)炎癥的影響

賀強　季瀏

摘 要：觀察4周游泳訓(xùn)練對db/db小鼠內(nèi)臟脂肪組織巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥的影響，探討運動抗炎的作用機制。將db/db小鼠和同窩野生小鼠各16只隨機分為相應(yīng)的對照組（WC、DC）和運動組（WE，DE）。小鼠進(jìn)行4周每天1 h、每周5 d的游泳運動。各組小鼠取附睪脂肪分離附睪脂肪組織基質(zhì)血管部分細(xì)胞（SVCs），流式細(xì)胞術(shù)檢測SVCs F4/80+CD11b+CD11c+和F4/80+CD11b+ CD11c-巨噬細(xì)胞；RT-PCR檢測炎癥相關(guān)基因表達(dá)。結(jié)果顯示db/db小鼠體質(zhì)量、附睪脂肪含量、空腹血糖（FBG）、SVCs數(shù)量、SVCs中 F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量及其百分?jǐn)?shù)、F4/80+CD11b+CD11c+巨噬細(xì)胞數(shù)量及其百分?jǐn)?shù)均顯著升高（P﹤0.05）；附睪脂肪TNF-α、IL-6、iNOS、F4/80、CD11c mRNA表達(dá)顯著升高（P﹤0.05）；IL-10、CD206、Arg1 mRNA表達(dá)顯著下降（P﹤0.05）。4周游泳訓(xùn)練顯著提高db/db 小鼠體質(zhì)量（P﹤0.05）；附睪脂肪含量無顯著差異；FBG、SVCs數(shù)量，SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量及其百分?jǐn)?shù)，F(xiàn)4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞中CD11c+巨噬細(xì)胞數(shù)量及其百分?jǐn)?shù)顯著下降（P﹤0.05）。附睪脂肪TNF-α、IL-6、iNOS、F4/80、CD11c mRNA表達(dá)顯著下降（P﹤0.05）；IL-10、CD206、Arg1 mRNA表達(dá)顯著升高（P﹤0.05）。4周游泳訓(xùn)練對野生型小鼠各項參數(shù)變化無顯著差異。結(jié)果說明：1） db/db小鼠附睪脂肪M1型促炎性巨噬細(xì)胞增加，炎癥因子基因表達(dá)提高；2）4周游泳訓(xùn)練有效降低db/db小鼠附睪脂肪巨噬細(xì)胞浸潤，降低M1型巨噬細(xì)胞，提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞表型，降低脂肪組織炎癥水平。

關(guān) 鍵 詞：運動生物化學(xué)；2型糖尿病；巨噬細(xì)胞；慢性炎癥；游泳訓(xùn)練；小鼠

中圖分類號：G804.7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1006-7116（2015）05-0133-06

Abstract： The authors observed the effects of 4-week swimming training on visceral fat tissue chronic inflammation mediated by macrophages in db/db mice， and probed into the working mechanism of exercise-induced anti-inflammation. The authors randomly divided 16 db/db mice and 16 wild littermate mice into corresponding control groups （WC and DC） and exercise groups （WE and DE）， let the mice swim 1 hour a day， 5 days a week， for 4 weeks， took epididymis fat pads out of the mice in various groups， separated stromal vascular fraction cells （SVCs） of epididymis fat tissues， analyzed SVCs F4/80+CD11b+CD11c+ and F4/80+CD11b+CD11c- macrophages by means of flow cytometry， determined inflammation related gene expressions by means of RT-PCR， and revealed the following findings： db/db mices body mass， epididymis fat content， fasting blood glucose （FBG）， SVCs number， F4/80+CD11b+ macrophage number and its percentage in SVCs， F4/80+CD11b+ CD11c+ macrophages number and its percentage increased significantly （P<0.05）， their epididymis fat TNF-α， IL-6， iNOS， F4/80 and CD11c mRNA expression increased significantly （P<0.05）， their epididymis fat IL-10， CD206 and Arg1 mRNA expression decreased significantly （P<0.05）； the 4-week swimming training significantly increased db/db mices body mass （P<0.05）， did not significantly change their epididymis fat content， significantly decreased their FBG， SVCs number， F4/80+CD11b+ macrophage number and its percentage in SVCs， CD11c+ macrophage number and its percentage in F4/80+CD11b+ macrophages （P<0.05）， significantly decreased their epididymis fat TNF-α， IL-6， iNOS， F4/80， CD11c mRNA expression （P<0.05）， and significantly increased their IL-10， CD206 and ARG1mRNA expression （P<0.05）； the 4-week swimming training did not significantly change various indexes of wild mice. The said findings indicate the followings： 1） as type M1 pro-inflammatory macrophages in epididymis fat of db/db mice increases， inflammatory cytokines gene expression increases； 2） the 4-week swimming training effectively reduced the infiltration of macrophages in epididymis fat of db/db mice， reduced type M1 macrophages， promoted type M2 anti-inflammatory macrophage phenotype， thus lowered fat tissue inflammation level.

Key words： sports biochemistry；type 2 diabetes；macrophage；chronic inflammation；swimming training；mouse

靜態(tài)生活方式、不良飲食結(jié)構(gòu)提高了2型糖尿病的發(fā)病風(fēng)險，全球范圍內(nèi)2型糖尿病人群持續(xù)升高，成為醫(yī)療衛(wèi)生面臨的重大課題。Hotamisligil[1-2]1993年發(fā)現(xiàn)肥胖、糖尿病動物脂肪組織中促炎癥因子TNF-α基因、蛋白表達(dá)均成倍增加，1994年發(fā)現(xiàn)TNF-α通過抑制胰島素受體的酪氨酸酶活性直接干擾胰島素信號通路，揭示了慢性炎癥為胰島素抵抗的病理機制之一，同樣為2型糖尿病常見的病理特征。Weisberg[3]2003年通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)肥胖動物脂肪組織中F4/80+染色陽性巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，為促炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-1β等的主要來源，極大地提高了對脂肪組織免疫細(xì)胞和代謝疾病之間的認(rèn)識。羅格列酮為糖尿病治療藥物，可有效降低肥胖動物脂肪組織中巨噬細(xì)胞炎癥，提示糖尿病的治療與脂肪組織巨噬細(xì)胞炎癥有關(guān)[4]。

2006年美國運動醫(yī)學(xué)會（ACSM）提出“運動是良藥”的健康理念，運動被列為疾病防控的常規(guī)治療手段，運動、營養(yǎng)、藥物作為治療2型糖尿病（T2DM）的三駕馬車，運動的經(jīng)濟(jì)性、廣泛的健康效應(yīng)更備受青睞，運動的抗炎效應(yīng)實為防治T2DM的關(guān)鍵途徑。前期研究發(fā)現(xiàn)，運動對肥胖動物模型慢性炎癥的改善與降低脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤、促炎表型有關(guān)[5]。運動對 2型糖尿病小鼠（db/db）脂肪組織巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥的影響和機制尚不清楚，以往運動對脂肪組織炎癥的研究多通過檢測炎癥因子基因表達(dá)的方法推測巨噬細(xì)胞數(shù)量變化、炎癥狀態(tài)，顯然不如流式細(xì)胞術(shù)準(zhǔn)確。本研究通過流式細(xì)胞術(shù)檢測純合瘦素受體自發(fā)突變（lepr-/-）的2型糖尿病小鼠（db/db）模型附睪脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤、表型分析，該小鼠表現(xiàn)為多食、多飲、多尿，3～4周產(chǎn)生肥胖表型，10～14 d胰島素和血糖開始升高，非常適合用于代謝類疾病研究。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

本實驗選用16只4周齡C57BLKS背景雄性瘦素受體自發(fā)突變純合子db/db小鼠（BKS.Cg-Dock7m+/+ Leprdb/JNju）作為2型糖尿病研究模型，同窩生野生小鼠16只，購自南京大學(xué)模式動物中心（SCXK（蘇）2010-0001）。適應(yīng)飼養(yǎng)1周后隨機分為野生安靜對照組（WC）、db/db安靜對照組（DC）、野生運動組（WE）和db/db游泳運動組（DE） ，每組8只。動物分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為室溫（23±1）℃，相對濕度控制在50%～60%，喂食國家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料，自由攝食飲水，12 h/12 h光照。

1.2 運動方案

對照組小鼠不施加任何運動干預(yù)，于籠中靜養(yǎng)；游泳運動組小鼠采用游泳運動：運動組小鼠在深為90 cm，直徑為60 cm的塑料水桶內(nèi)進(jìn)行游泳，水溫控制在（31±1）℃，水深控制在（60～65）cm。運動組小鼠適應(yīng)性運動1周：第1、2天適應(yīng)性游泳15 min，第3天30 min，第4、5天45 min，降低小鼠對水的應(yīng)激反應(yīng)，休息2 d執(zhí)行正式運動方案：每天游泳60 min，每周5 d，共4周。

1.3 組織取材和指標(biāo)測試

1）附睪脂肪組織SVCs分離和流式分析。

末次訓(xùn)練結(jié)束禁食12 h，血糖儀（日本京都1640血糖儀）檢測小鼠空腹血糖，斷頸處死小鼠，取雙側(cè)附睪脂肪，分離脂肪組織SVCs：50 mg附睪脂肪組織，預(yù)冷1×PBS 緩沖液清洗2～3次，去掉血跡和毛發(fā)，F(xiàn)ACS buffer （1×PBS緩沖液+2%BSA）中剪碎，500 g 4 ℃離心5 min，加入2 mg/mL 2型膠原酶消化液（FACS buffer稀釋），37 ℃搖床恒溫水浴消化45 min，100 ?m孔徑細(xì)胞篩網(wǎng)（美國BD）過濾細(xì)胞懸液，過濾掉細(xì)胞團(tuán)塊和無法消化的結(jié)締組織，1 000 g離心5 min，棄上層脂肪細(xì)胞，收集底層SVCs細(xì)胞團(tuán)，F(xiàn)ACS buffer重懸細(xì)胞[6]。附睪脂肪SVCs的流式細(xì)胞儀分析20 ?g/mL FC-Block抗體4℃孵育附睪脂肪SVCs細(xì)胞20 min，小鼠F4/80 Percp-cy5.5、CD11b Pacific blue、CD11c APC-cy7熒光標(biāo)記流式抗體和IgG抗體暗室孵育細(xì)胞20 min。美國BD FACS CantoII型流式細(xì)胞儀分離SVCs中F4/80+ CD11b+和F4/80+CD11b+ CD11c+巨噬細(xì)胞。

2）Real-time PCR法測定附睪脂肪組織基因表達(dá)。

Trizol法提取小鼠附睪脂肪總RNA：200 mg附睪脂肪于2 mL研磨管（含磁珠），加入1.5 mL Trizol試劑（Invitrogen），剪碎組織，勻漿（美國OMNI Bead Ruptor24） 2～3次，每次30 s，間隔15 s，12 000 g 4 ℃離心10 min，吸棄上層300 ?L油脂避免污染RNA，收集上清，加入200 μL氯仿，室溫靜置5 min，12 000 g 4 ℃離心15 min，收集上層水相400 μL，加入400 μL異丙醇，室溫靜置10 min。12 000 g 4 ℃離心10 min，棄上清，加入1 mL 體積分?jǐn)?shù)為75%乙醇，7 500 g 4 ℃離心5 min，吸棄上清，空氣干燥5～10 min，加入40 μL DEPC水（碧云天），55～60 ℃水浴助溶，超微量分光光度計（美國NanoVue Puls）測定RNA D（λ）值和D（260）/D（280），計算RNA濃度后于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)錅y。cDNA合成試劑盒（TOYOBO FSQ-101）進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)（BIO-RAD PCR儀）：反應(yīng)條件為37 ℃ 15 min→98 ℃ 5 min→4 ℃，采用SYBR Green摻入法，利用TOYOBO SYBR Green Realtime PCR Master Mix（QPK-201）試劑盒在ABI熒光實時定量PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95 ℃ 1 min→95 ℃ 15 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 45 s共45個循環(huán)，目標(biāo)基因引物見表1。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

通過Graph Pad 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，組間采用雙因素方差分析，以P<0.05為顯著性差異。

2 結(jié)果及分析

2.1 四周游泳訓(xùn)練對db/db小鼠生理和代謝的影響

如表2所示，與WC組比較，DC組小鼠體質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量、附睪脂肪質(zhì)量與體質(zhì)量百分比、空腹血糖濃度顯著增加（P<0.05）；與WC組比較，WE組小鼠各種參數(shù)普遍表現(xiàn)出下降趨勢，但并無顯著性差異；與DC組比較，DE組小鼠體質(zhì)量顯著升高（P<0.05），附睪脂肪質(zhì)量及其與體質(zhì)量百分比均無顯著性差異，空腹血糖濃度顯著下降（P<0.05）。

2.2 四周游泳訓(xùn)練對db/db小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞浸潤和表型的影響

圖1為各組小鼠附睪脂肪組織SVCs的流式細(xì)胞術(shù)分析模式圖，P1門為SVCs，P2門為F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞，P3門為F4/80+CD11b+ CD11c+巨噬細(xì)胞。表3 表明，與WC 組比較，DC組小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量顯著增加（P<0.05），SVCs中F4/80+CD11b+ 巨噬細(xì)胞數(shù)量、百分?jǐn)?shù)顯著增加（P<0.05），F(xiàn)4/80+CD11b+ 巨噬細(xì)胞中CD11c+ 巨噬細(xì)胞數(shù)量、百分?jǐn)?shù)顯著增加（P<0.05）；與WC組比較，WE組小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量、SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量、百分?jǐn)?shù)和F4/80+CD11b+ 巨噬細(xì)胞中CD11c+ 巨噬細(xì)胞數(shù)量、百分?jǐn)?shù)無顯著差異。與DC組比較，DE組小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量顯著下降（P<0.05），SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量和百分?jǐn)?shù)顯著下降（P<0.05），F(xiàn)4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞中CD11c+ 巨噬細(xì)胞數(shù)量和百分?jǐn)?shù)顯著下降（P<0.05）。

2.3 四周游泳訓(xùn)練對db/db小鼠脂肪巨噬細(xì)胞標(biāo)志物基因表達(dá)的影響

表4表明，與WC組比較，DC組小鼠附睪脂肪F4/80、CD11c mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05），CD206、Arg1mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.05）；與WC組比較，WE組小鼠各參數(shù)無顯著差異；與DC組比較，DE組小鼠F4/80、CD11c mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.05），CD206和ARG1mRNA表達(dá)顯著升高。

2.4 四周游泳訓(xùn)練對db/db小鼠脂肪炎癥基因表達(dá)的影響

表5表明，與WC組比較，DC 組小鼠附睪脂肪TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05），IL-10 mRNA顯著下降（P<0.05）；與WC組比較，WE組小鼠各項參數(shù)無顯著差異。與DC組比較，DE組小鼠TNF-α、IL-6、iNOS、mRNA表達(dá)顯著下降（P<0.05），IL-10 mRNA表達(dá)顯著升高（P<0.05）。

3 討論

3.1 四周游泳訓(xùn)練對脂肪組織巨噬細(xì)胞數(shù)量和表型的影響

脂肪組織基質(zhì)血管部分（stromal vascular fraction，SVF）富含間充質(zhì)干細(xì)胞、前體脂肪細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞[7]。SVCs數(shù)量與脂肪組織的肥胖程度相關(guān)，隨高脂膳食干預(yù)時間延長小鼠附睪脂肪含量增加的同時SVCs數(shù)量進(jìn)行性增加[8]。本研究發(fā)現(xiàn)db/db小鼠附睪脂肪中SVCs數(shù)量明顯增加。運動對脂肪組織SVCs數(shù)量的影響尚不清楚，也無類似研究先例，4周游泳訓(xùn)練對野生小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量的影響并不顯著，不過4周游泳訓(xùn)練顯著降低db/db小鼠附睪脂肪SVCs數(shù)量。Nishimura[9]探索ob/ob小鼠附睪脂肪SVCs中免疫細(xì)胞的組成，發(fā)現(xiàn)F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量最多，約為30%。脂肪組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量隨肥胖程度進(jìn)行性增加，巨噬細(xì)胞數(shù)量、炎癥狀態(tài)與胰島素抵抗高度相關(guān)[10]。肥胖動物內(nèi)臟脂肪組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于皮下脂肪組織，因此內(nèi)臟脂肪組織對慢性炎癥、胰島素抵抗的作用更為突出，所以脂肪組織慢性炎癥研究通常選擇附睪脂肪[11]。

巨噬細(xì)胞根據(jù)炎癥特性分為經(jīng)典激活（M1）和替代性激活（M2），F(xiàn)4/80、CD11b為巨噬細(xì)胞常見的分子標(biāo)志物，M2型巨噬細(xì)胞分泌抗炎因子IL-10，豐富表達(dá)精氨酸酶（Arginase1），可與iNOS競爭性催化底物L(fēng)-精氨酸，抑制NO產(chǎn)生，經(jīng)典標(biāo)志物為CD206、CD163等；M1型巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-6等一系列促炎癥因子，iNOS表達(dá)增加催化底物L(fēng)-精氨酸，產(chǎn)生NO，經(jīng)典標(biāo)志物為CD11c[11]。通過F4/80、CD11b、CD11c熒光標(biāo)記抗體分離db/db小鼠附睪脂肪組織SVCs中F4/80+CD11b+ CD11c+ （M1）和F4/80+CD11b+ CD11c- （M2）巨噬細(xì)胞，研究分析4周游泳訓(xùn)練對db/db小鼠附睪脂肪巨噬細(xì)胞的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)db/db小鼠附睪脂肪SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量和百分?jǐn)?shù)增加，F(xiàn)4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞中CD11c+/M1型巨噬細(xì)胞及其比例遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于野生小鼠，提示促炎癥的巨噬細(xì)胞數(shù)量顯著增加，結(jié)果同營養(yǎng)性肥胖小鼠附睪脂肪巨噬細(xì)胞變化相似。Nguyen[6]發(fā)現(xiàn)ob/ob小鼠附睪脂肪組織F4/80+巨噬細(xì)胞百分?jǐn)?shù)（55.5±2.3）%顯著高于野生對照組（35.1±1.1）%，C57BL/6小鼠附睪脂SVCs中F4/80+、F4/80+CD11b+ CD11c+巨噬細(xì)胞數(shù)量隨肥胖程度進(jìn)行性增加。4周游泳訓(xùn)練顯著降低db/db小鼠附睪脂肪SVCs中F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞的數(shù)量及其百分?jǐn)?shù)和F4/80+CD11b+ CD11c+ 細(xì)胞及其百分?jǐn)?shù)，對野生小鼠相同指標(biāo)影響則不明顯，因此可以推斷4周游泳訓(xùn)練降低db/db小鼠附睪脂肪組織SVCs數(shù)量部分與F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞數(shù)量減少有關(guān)。很明顯50 mg附睪脂肪無法分離出明顯的F4/80+CD11b+CD11c-細(xì)胞群，無法直觀地判定F4/80+CD11b+CD11c-細(xì)胞亞群的變化趨勢。

3.2 四周游泳運動對脂肪組織巨噬細(xì)胞炎癥標(biāo)志物基因表達(dá)的影響

db/db小鼠附睪脂肪F4/80、CD11c mRNA表達(dá)顯著高于同窩野生小鼠，進(jìn)一步表明db/db小鼠附睪脂肪中巨噬細(xì)胞，尤其M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量的增加。TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表達(dá)的顯著升高表明脂肪組織炎癥水平的升高，同時CD206、IL-10和Arg1基因表達(dá)的顯著下降提示M2型巨噬細(xì)胞數(shù)量下降，抗炎功能下降或受到抑制。前期研究表明db/db小鼠附睪脂肪F4/80+染色陽性細(xì)胞數(shù)目增加，F(xiàn)4/80、CD68、TNF-α、IL-6、CD11c、MCP-1mRNA等表達(dá)顯著提高[12-13]，這些研究結(jié)果同ob/ob、小鼠營養(yǎng)性肥胖小鼠脂肪組織巨噬細(xì)胞炎癥特征基本一致[14]。有氧運動對改善2型糖尿病患者胰島素抵抗、降低外周血中炎癥標(biāo)志物有良好的效果[15]，動物實驗也發(fā)現(xiàn)2周中等強度運動可降低db/db小鼠外周血中炎癥蛋白[16]，然而運動對db/db小鼠脂肪炎癥基因表達(dá)的影響沒見報道。本研究發(fā)現(xiàn)4周游泳訓(xùn)練顯著降低db/db小鼠附睪脂肪F4/80、CD11c、TNF-α、IL-6、iNOS mRNA表達(dá)，提高了IL-10、Arg1、CD206 mRNA表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)同運動對肥胖小鼠附睪脂肪炎癥的改善效果相似，Kawanishi[5]發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)性肥胖小鼠附睪脂肪F4/80、CD11c、TNF-α mRNA表達(dá)顯著升高，CD163 mRNA表達(dá)顯著下降，16周耐力跑臺運動顯著降低F4/80、CD11c mRNA表達(dá)，提高CD163mRNA表達(dá)，降低脂肪組織炎癥。Bradely[17]發(fā)現(xiàn)6周自主跑輪運動顯著降低高脂膳食小鼠TNF-α、MCP-1等促炎因子mRNA表達(dá)。Vieira[18]發(fā)現(xiàn)12周65%～70%VO2max跑臺運動降低脂肪組織F4/80、TNF-α表達(dá)，同時降低機體炎癥水平，改善胰島素抵抗。

db/db小鼠附睪脂肪M1型（F4/80+CD11b+CD11c+） 巨噬細(xì)胞增多，炎癥因子基因表達(dá)水平明顯高于野生小鼠；4周游泳訓(xùn)練有效降低附睪脂肪F4/80+CD11b+巨噬細(xì)胞浸潤，尤其降低M1型巨噬細(xì)胞數(shù)量，提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞表型，降低db/db小鼠附睪脂肪炎癥水平。

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