保肺定喘湯對COPD大鼠瘦素及下丘腦JAK2/STAT3通路的影響研究

陳芳　徐志波　陳彬　王璐　何薇　胡敬獻

保肺定喘湯對COPD大鼠瘦素及下丘腦JAK2/STAT3通路的影響研究

陳芳徐志波陳彬王璐何薇胡敬獻

目的 探討保肺定喘湯對COPD大鼠瘦素及下丘腦瘦素受體活化后信號通路JAK2/STAT3的影響。方法 將40只SD大鼠隨機分為4組：正常組、保肺定喘湯預防組、保肺定喘湯治療組和COPD組，每組各10只。除正常組外，各組大鼠在自制熏煙箱內被動吸煙24周，并在第30天和第45天于氣道內滴入脂多糖（LPS）。觀察各組大鼠的一般情況，檢測血清瘦素水平，肺組織HE染色，Western-Blot法測定下丘腦STAT3、PIAS3、SOCS3相對表達量。結果 保肺定喘湯預防組與治療組大鼠體重、血清瘦素水平均明顯高于COPD組（P＜0.05、P＜0.01）。保肺定喘湯預防組與治療組STAT3、PIAS3均低于COPD組（P均＜0.01）；保肺定喘湯預防組與治療組SOCS3高于COPD組，差異均有統計學意義（P＜0.05），且兩組SOCS3相對表達量與正常組比較差異有顯著性（P＜0.01）。結論 保肺定喘湯能夠減輕長期吸煙導致的COPD大鼠氣道重塑，增加體重，提高血清瘦素水平，其機理與下丘腦信號通路JAK2/STAT3相關，使STAT3、PIAS3表達上調，SOCS3表達下調。

保肺定喘湯 慢性阻塞性肺疾病 瘦素 大鼠

慢性阻塞性肺疾病（chronic obstructive pulmonary disease，COPD），是呼吸系統的常見疾病，其以持續存在的氣流受限為特征［1］，還伴有嚴重的肺外表現，嚴重影響患者的生活質量，增加死亡率。營養不良是其肺外表現的最重要特征之一，常表現為消瘦、乏力、營養狀況低下等癥狀，其發生不僅與COPD持續存在的炎癥反應導致組織代謝消耗增加相關，還與瘦素介導的飲食攝入減少有關。保肺定喘湯從整體觀念出發在臨床應用于COPD患者具有良好的療效。前期實驗已經證實，保肺定喘湯對COPD大鼠具有祛痰、止咳、改善氣道重塑和增加體重的作用，但其對于營養狀況改善的具體機制尚不明確［2］。作者自2012年9月至2014年9月以熏煙加氣道滴入脂多糖（LPS）法建立COPD模型，探討保肺定喘湯對COPD大鼠瘦素及其下丘腦瘦素受體磷酸化后信號轉導分子的作用。

1　材料和方法

1.1試驗動物 清潔級SD成年大鼠40只，雄性，體重（217±13）g，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，每籠5只飼養于浙江中醫藥大學動物實驗中心，室溫（20±2）℃，濕度40%～70%，12h交替采光，普通飼料喂養，自由飲水進食。

1.2實驗用藥 采用驗方—保肺定喘湯（由黃芪、黨參、當歸、丹參、熟地等組成），由浙江中醫藥大學制劑室制備成流浸膏（含生藥3.1g/ml），加0.9%氯化鈉溶液按1.2：0.8的比例配成2ml保肺定喘湯稀釋品。實驗用煙為雄獅牌過濾嘴香煙（浙江中煙工業有限責任公司出品，焦油量8mg，煙氣煙堿量0.7mg）。

1.3試劑及主要儀器 LPS（美國Sigma公司）；瘦素酶聯免疫吸附測定試劑盒（武漢新啟迪生物科技有限公司）；BCA蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）；anti-STAT3 （Phospho-Tyr705） antibody（Anbobio公司，批號：A7224）；anti- SOCS-3 （H-103） antibody（Santa Cruz公司，批號：sc-9023）；anti-PIAS 3 （H-169）antibody（Santa Cruz公司，批號：sc-14017）；內參β-actin（Santa Cruz公司）；羊抗小鼠IgG-HRP、羊抗兔IgG-HRP（均購自美國Pierce公司）；甲醇、水合氯醛等常規試劑（華東醫藥集團有限公司）。蛋白紫外分光光度計（德國Eppendorf公司）；Mini-PROTEAN垂直電泳和轉膜系統（美國Bio-Rad公司）。

1.4實驗方法 （1）動物分組及造模方法：將40只清潔級SD大鼠依隨機數字表法分成正常組10只，吸煙組30只（保肺定喘湯預防組10只、保肺定喘湯治療組10只、COPD組10只）。采用和改進張金梅等［3］的造模方法，保肺定喘湯預防組、治療組、COPD組每天均在自制熏煙機里吸煙2h（上、下午各1h），維持煙箱內煙霧濃度450～500bpm。在造模第30、45天分別于吸煙組大鼠氣道滴入LPS 0.2ml，滴入LPS當天不吸煙，共吸煙24周。預防組在造模開始時即予2ml保肺定喘湯灌胃1次/d，共24周，治療組予2ml 0.9%氯化鈉溶液灌胃1次/d直至第20周調整為保肺定喘湯2ml灌胃1次/d，共1個月。正常組與吸煙組飼養環境相同，但不吸煙，不灌胃。（2）標本采集：大鼠吸煙24周，常規稱重后予10%水合氯醛（0.3ml/100g） 腹腔內注射麻醉，腹主動脈取血5ml，置于預冷的負壓真空采血管中，靜置30min后，于離心機中以 2000r/min，4℃離心10min，收集上清液分裝至-70℃冰箱中保存；分離肺組織，10%中性甲醛溶液固定；按張殿全等［4］方法，在枕骨大孔處切斷延髓，分離出下丘腦，液氮罐中凍存。（3）肺組織病理切片制作：將甲醛溶液固定24h的肺組織，按病理切片制作方法，常規取材脫水、石蠟包埋、切片，行HE染色，中性樹膠封片，并在顯微鏡100倍視野下觀察肺組織結構變化、炎癥細胞浸潤、管壁纖維增生程度及管腔變形狹窄等方面，選取典型視野并拍照。然后再使用Image－ProPlus 5.0圖像分析軟件對各細支氣管面積，周長，厚度進行測量。（4）大鼠血清瘦素的測定： ELISA法測定各組血清瘦素。（5）下丘腦STAT3、STAT3蛋白抑制因子（PIAS）、細胞因子信號傳導的抑制因子3（SOCS3）測定：將分離的下丘腦，進行總蛋白的提取和定量，SDS- PAGE電泳分析、蛋白質轉膜、轉印膜和封閉、一抗孵育、二抗孵育、顯影及定影等步驟。

1.5統計學處理 采用SPSS17.0統計軟件包。計量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析，組間比較采用LSD檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1一般情況 除正常組外，吸煙各組大鼠毛色漸變干枯毛糙、萎黃；熏煙開始前5周，各組大鼠較正常組精神亢奮，飲食、大小便同正常組；從第6周開始，預防組、治療組、COPD組均出現飲食量及體重增量較正常組減少，且預防組各大鼠精神漸趨安靜，活動量明顯減少，間或出現稀便，而COPD組大鼠性情趨向狂躁。

2.2體重和血清瘦素水平 從實驗第2周開始，吸煙組體重增速較正常組減慢，以第6周后明顯。第24周，正常組與吸煙各組差異有顯著性（P＜0.01），而預防組、治療組、COPD組差異無統計學意義（P＞0.05）（如表1）。COPD組大鼠血清瘦素與正常組、預防組、治療組差異有顯著性（P＜0.01），而正常組、預防組、治療組之間差異無統計學意義（P＜0.05），見表1。

表1　各組大鼠體重、血清瘦素水平檢測結果（s）

表1　各組大鼠體重、血清瘦素水平檢測結果（s）

注：與COPD組比較 *P＜0.01，△P＜0.05；與正常組比較 #P＜0.01

組別只體重（g）瘦素（ng/kg）正常組10537.2±29.7 *4.64±0.92*預防組10475.6±15.6△#4.44±1.41*治療組10460.5±28.2 #4.15±1.57*# COPD組10447.3±28.3 #2.40±0.98#

2.3肺組織病理檢查結果 吸煙各組大鼠小氣道均出現不同程度的炎癥細胞浸潤和氣道重塑。各組大鼠細支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長（此三個指標為COPD造模評判標準）比較結果，見圖1、見表2。

表2　各組大鼠細支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長統計結果（±s）

表2　各組大鼠細支氣管管壁厚度、管壁面積、管壁面積/腔周長統計結果（±s）

注：與COPD組比較*P＜0.01，□P＜0.01，△P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.01，□P＜0.05

組別只管壁厚度（μm）管壁面積（μm2）管壁面積/腔周長（μm2/μm）正常組104.08±0.17 *11.66±0.44 *4.22±0.23 *預防組104.29±0.20 * #12.04±0.71 △ □4.55±0.43 △ #治療組104.27±0.25 * #12.03±0.74 △ □4.57±0.33 △ # COPD組104.49±0.2412.43±0.634.74±0.20

2.4下丘腦STAT3、PIAS3、SOCS3相對表達量 見表3。

表3　Western-Blot法檢測各組大鼠下丘腦STAT3、PIAS3、SOCS3相對表達量（±s）

表3　Western-Blot法檢測各組大鼠下丘腦STAT3、PIAS3、SOCS3相對表達量（±s）

注：與COPD組比較*P＜0.01，□P＜0.01，△P＜0.05；與正常組比較，#P＜0.01

組別只STAT3PIAS3 SOCS3正常組1019.38±1.57* 20.80±1.65*23.04±1.92*預防組1021.92±1.72 * 25.95±0.85 * #20.04±1.08 △ #治療組1026.38±2.75 *# 26.90±1.40 * #20.28±1.35 △ # COPD組1031.96±1.94 # 29.79±1.80 #18.20±0.78 #

圖1　各組大鼠細支氣管病理HE染色切片（×100倍）

3　討論

被動吸煙及氣道滴入LPS，最終可導致氣道重塑，造模24周后，吸煙各組大鼠小氣道不同程度出現管壁增厚、管腔狹窄、炎性細胞浸潤，提示COPD造模成功。瘦素由肥胖基因編碼，主要是由脂肪組織分泌，其主要功能是通過與下丘腦瘦素受體結合，引起受體后JAK2/STAT3信號傳導途徑的變化，最終可抑制神經肽分泌，抑制食欲、減少攝食、增加能量輸出［5］。本實驗研究結果表明，COPD組瘦素水平明顯低于正常組，這與Karakas在研究COPD穩定期患者瘦素水平的結論相符［6］，即瘦素水平與體內脂肪呈正相關。而保肺定喘湯預防組和治療組瘦素水平較COPD組高，說明保肺定喘湯對體脂有積極的改善作用。SOCS3是由瘦素介導STAT3活化并進入核內，特異性誘導產生的，其作用可通過負反饋來抑制激活的JAK/STAT3信號途徑［7］，從而減輕厭食效應。而活化的PIAS卻不受瘦素誘導產生，其作用主要是激活PIAS3［8］，與活化的STAT3專一結合，并阻斷STAT3與DNA結合，削弱JAK2/STAT3途徑介導的厭食效應。本實驗COPD組大鼠下丘腦STAT3、PIAS3均較正常組表達上調，而 SOCS3表達下調，體現了瘦素介導的下丘腦信號轉導分子在介導COPD營養不良時有重要作用。但從保肺定喘湯預防組和治療組兩組大鼠下丘腦STAT3、PIAS3表達水平上調，雖均較正常組有所上調，但不及COPD組明顯。

保肺定喘湯是常用于COPD患者穩定期補益肺腎的經驗方。本次實驗采用保肺定喘湯對吸煙導致的COPD大鼠進行預防和治療，能增加 COPD大鼠的攝食、緩解體重下降，上調COPD大鼠下丘腦PIAS3、 SOCS3的表達，改善營養不良。因此，本實驗結果提示保肺定喘湯對抗COPD患者瘦素引起的厭食反應，通過下調或上調下丘腦JAK2/STAT3通路STAT3、PIAS3、SOCS3信號轉導分子起作用，從而提高患者的生活質量和生存率，而不僅只體現在對COPD患者的抗炎、控制炎癥等作用上。

1 Global Initiative for Chronic Obstructive Lung Disease. Global strategy of the diagnosis, management, and prevention of chronic obstructive pulmonary disease. Guidelines global strategy for diagnosis management, Revised 2014 （Online）.

2 駱仙芳,沈華浩.保肺定喘湯對慢性阻塞性肺疾病大鼠VEGF表達的影響.中華中醫藥學刊,2007,25（8）：1624～1626.

3 張金梅,孫麗華,谷偉,等.慢性阻塞性肺疾病大鼠血清及肺組織中肺表面活性蛋白D的水平變化及意義.中國呼吸與危重監護雜志,2012,11（4）：330～334.

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8 Brichard SM,Delporte ML,Lambert M. Adipocytokines in anorexia nervosa：a review focusing on leptin and adiponectin .Horm Metab Res,2003,35 （6）：337～342.

Objective To discuss the treatment effect of Baofei Dingchuan decoction on leptin and hypothalamus JAK2 / STAT3 pathway in COPD rat model. Method 40 SD mices are randomly divided into normal group， prevention and treatment group of Baofei Dingchuan decoction and COPD group， each group have 10 SD rats. In addition to the normal group， each group of rats were explored smoking in homemade box during the 24 weeks. At the time of 30 and 45 days， each mice of prevention and treatment group of Baofei Dingchuan decoction and COPD group are dripped LPS into its airway. Prevention group were given Baodei Dingchuan decoction at the beginning of Passive smoking. While treatment group were given at the end of 4 weeks. At last， all the rats were executed and detected their serum leptin. Pathological examination on lung tissue， and determination relative expression of hypothalamus STAT3、PIAS3、SOCS3 by Western-Blot method. Results Rats of prevention and treatment groups were higher than the COPD group （P＜0.05， P＜0.01） in weight and leptin level. The expression of STAT3， PIAS3 in Prevention and treatment groups were lower than the COPD group （P＜0.01）. The SOCS3 levels of prevention and treatment groups were higher than COPD group （P＜0.05） .Compared with normal group， there are signifi cant differences （P＜0.01）. Conclusion Baofei Dingchuan decoction can alleviate the airway remodeling and increase the weight in long-term smoking induced COPD rats model. The level of serum leptin also improved by the treatment of Baofei Dingchuan decoction. The mechanism might associated with the hypothalamus JAK2 / STAT3 pathway. It can up-regulate the expression of STAT3， PIAS3 and down-regulate the expression of SOCS3 in COPD rat models.

Baofei Dingchuan decoction COPD Leptin Rats

國家自然科學基金項目（2012R10063）；浙江省中醫藥管理局項目（2011ZQ009）；浙江省衛生廳項目（2013KYA140）

310006 浙江中醫藥大學附屬第一醫院