兒童異型淋巴細胞增多與CMV、EBV感染相關性研究

章浙忠　許健駱豐　楊嘯曉

兒童異型淋巴細胞增多與CMV、EBV感染相關性研究

章浙忠許健★駱豐楊嘯曉

目的 探討患兒感染CMV、EBV后，異型淋巴細胞數量與CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG水平，以及與CMV-DNA和EBV-DNA之間的相關性，為患兒治療CMV和EBV提供實驗室依據。方法 收集異型淋巴細胞增多（陽性：異型淋巴細胞＞3%）兒科臨床病例95例，采用ELISA法檢測患者血清中CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG水平，Real-time PCR法檢測患者CMV-DNA 和EBV-DNA含量，瑞吉染色計數異型淋巴細胞。結果 95例異型淋巴細胞陽性患者體內CMV-IgM和EBV-IgM陽性率達1.1%和5.3%；CMV-IgG和EBV-IgG陽性率為52.6%和31.6%；PCR結果顯示CMV-DNA和EB-DNA陽性率分別為17.9%和22.1%。其中50例CMV-IgG檢測陽性的患者CMV-DNA陽性率高達30%；30例EBV-IgG檢測陽性的患者EBV-DNA陽性率高達36.7%；5例EBV-IgM檢測陽性的患者僅1例EB-DNA檢測為陰性。結論 異型淋巴細胞增多與CMV、EBV感染具有一定的相關性，且CMV-IgG和EBV-IgG在診療過程中具有一定臨床意義。懷疑患兒感染CMV和EBV時，合并異型淋巴細胞、CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG以及EBV-DNA水平聯合診斷對臨床具有重要意義。

異型淋巴細胞 巨細胞病毒 EB病毒

異型淋巴細胞又稱病毒細胞、非典型淋巴細胞、傳染性單核細胞等，多見于EB病毒（EBV）和巨細胞病毒（CMV）等感染［1］。傳染性單核細胞增多癥是指EBV感染引起的單核-巨噬細胞系統性增生性傳染病。但近期研究發現CMV病毒亦可引起傳染性單核細胞增多綜合征［2］，可經血清學檢測IgM抗體陽性或PCR檢測DNA陽性診斷［3，4］。作者對血液中存在異型淋巴細胞患者血清中的CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG水平以及EBV-DNA、CMV-DNA水平進行檢測，并觀察CMV和EBV感染陽性患者外周血中異型淋巴細胞的改變，綜合分析比較它們之間的聯系，為醫務人員診斷EBV和CMV感染提供參考依據。

1　材料與方法

1.1標本來源 收集2012年1月至2014年9月于浙江省中醫院兒科有異型淋巴細胞增多血液標本95例，其中男45例，女50例；1～7歲占84.2%，其他年齡段占15.8%。

1.2儀器與試劑 雙目光學顯微鏡；實時熒光定量PCR儀（ABI，USA，ABI7500）；酶標儀（寶特，USA，ELX808）；EBV核酸定量檢測試劑盒（達安基生物有限公司）； CMV病毒核酸定量檢測試劑盒（達安基生物有限公司）； CMV ELLSA試劑盒（美國美德聲科學技術公司）；EBV ELISA試劑盒（北京貝爾生物工程有限公司）。瑞吉染液（珠海貝索生物技術有限公司）。

1.3方法 （1）按《全國臨床檢驗操作規程》［5］的要求制備2張良好血涂片，瑞吉染液染色，異型淋巴細胞數＞3%為陽性。（2）分離血清用ELISA檢測試劑盒檢測CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG水平。（3）實時熒光定量PCR儀檢測血標本中CMV-DNA和EBV-DNA水平。①標本處理：患者靜脈血分離血清，取50μl血清加50μlDNA提取液混勻，離心后取含病毒DNA上清液5μl做PCR擴增。②取預混有引物的PCR反應管，加入含病毒DNA上清液，將反應管放入PCR儀的樣品槽內，按對應順序設置陰性、陽性定量質控參考品梯度以及未知標本，并設置樣品名稱、標記熒光基團種類和循環參數，反應結束后儀器自動分析計算出標本數值（Qty）。③陽性判斷：CMVDNA＞2.5×104copies/ml；EBV-DNA＞5.0×104copies/ml。

2　結果

2.1瑞氏-吉姆薩染色液染色手工分類 95例標本中89例為單核型的異型淋巴細胞，4例為單核型和和漿細胞型混合感染的異型淋巴細胞，2例為幼稚型的異型淋巴細胞。見圖1～3。

圖1　幼稚細胞型異型淋巴細胞

圖2　單核細胞型異型淋巴細胞

圖3　漿細胞型異型淋巴細胞

2.2異形淋巴細胞陽性患者血清 CMV-IgM、IgG， EBV-IgM、IgG的 ELISA檢測結果以及EBV-DNA 、CMV-DNA 的PCR檢測結果 見表1。

表1　異型淋巴細胞檢測陽性血清CMV-IgM、CMV-IgG、EBV-IgM、EBV-IgG、EBV-DNA和CMV-DNA檢測結果（n）

2.3CMV-IgG和EBV-IgG陽性患者的血清CMV-DNA和EBV-DNA PCR檢測結果 見表2。

表2　CMV-IgG和EBV-IgG陽性患者中CMV-DNA和EBV-DNA 檢測結果（n）

2.4CMV-IgM和EBV-IgM陽性患者的血清CMV-DNA和EBV-DNA PCR檢測結果 見表3。

表3　CMV-IgM和EBV-IgM陽性患者血清CMV-DNA和EBV-DNA檢測結果（n）

3　討論

傳染性單核細胞癥臨床表現以小兒發熱、咳嗽、淋巴結和肝脾腫大等癥狀為主［6］。EBV是一種嗜B淋巴細胞的皰疹病毒，可引起典型的傳染性單核細胞增多癥表現［7，8］，或呈隱性感染狀態并終生帶毒［9，10］。文獻提示EBV可引起腦炎［11］、腦膜炎、多發性硬化癥等神經系統疾病。CMV具有潛伏-活動的生物學特征［12］，可引起神經性耳聾和不同程度的神經運動障礙。異常淋巴細胞形態各異，一般分三型：Ⅰ型為泡沫型，其染色質呈粗網或成堆排列，核偏位，胞漿中有大小不一泡沫樣空泡；Ⅱ型是不規則型，核圓、橢圓或不規則，染色質稍細呈單核樣，胞漿豐富； Ⅲ型是幼稚型，染色質細致均勻，可見核仁。對存在異型淋巴細胞患者的血清進行CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG以及EBV-DNA檢測，患者血清中CMV和EBV抗體的檢出說明患者體內存在CMV和EBV早期或既往感染，同時也論證了異型淋巴細胞與CMV和EBV具有一定的相關性。CMV和EBV感染后患者以Ⅱ型異常淋巴細胞為主，主要表現為胞漿增多，染色質單核樣改變為主，少見泡沫型和幼稚型。患者體內出現的反應性變異 T 淋巴細胞增多，故有淋巴結腫大的表現［13］。

CMV和EBV均屬皰疹病毒科，為雙鏈線狀DNA病毒［14］。兒童主要通過胎盤、母乳等方式感染CMV。當小兒機體免疫缺陷或免疫系統處于抑制狀態，則易引起肺炎或神經系統發育障礙等疾病。EBV具有嗜B淋巴細胞的特征，能夠在已產生抗體的宿主細胞內持續存在［15］。兒童感染EBV后癥狀表現不一，在早期易發生誤診［16］。CMV-IgM和EBV-IgM可作為急性感染的診斷指標，因半衰期較短，可在體內持續3個月。從患者血清中檢出IgM抗體，表明患者最近發生了病毒感染。CMV-IgG和EBV-IgG是既往病毒感染后，機體自身免疫產生的抗體，表明患者對該病毒具有免疫力。CMV和EBV DNA呈陽性，表明患者體內存在病毒感染。IgM陽性、DNA陽性，考慮急性的早期感染期已過，IgM型抗體在血中的滴度已下降，機體通過自身免疫開始產生抗病毒的IgG，病毒還在機體內不斷復制［17］。不容忽視的是，CMV和EBV均具有潛伏性，因此極有可能在潛伏期后，人體抵抗力低下時，又出現病毒活動。因此兒童在CMV-IgG和EBVIgG檢測為陽性，且符合病毒感染癥狀時，更應注重CMV-DNA和EBV-DNA的及時檢測。對CMV-IgM和EBV-IgM陽性患兒的血清同時進行PCR檢測，當IgM和DNA均呈陽性時，既是發病早期又是病毒復制期（但兒童患者免疫反應較弱，可呈假陰性），故應積極治療，避免病情的加重。

不同方法的檢測結果代表著不同的臨床意義，ELISA法雖然特異性較高，但病毒需達到納克水平。PCR檢測具有敏感度高，快速簡便等優點，但特異性不高。因此，懷疑患兒感染CMV和EBV時，對異型淋巴細胞以及CMV-IgM、CMV-IgG、CMV-DNA、EBV-IgM、EBV-IgG和EBV-DNA聯合檢測對診斷具有重要的意義，為臨床醫生綜合分析病情，降低誤診，及早、及時、有效治療表明患者體內存在病毒感染。IgG陽性、DNA陽性感染患兒提供實驗室依據。

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Objective Probe the correlation of atypical lymphocyte with CMV-IgM， CMV-IgG， CMV-DNA， EBV-IgM， EBV-IgG and EBV-DNA in pediatric patients， provide experimental basis for treatment of CMV and EBV infection in children patients. Methods Collected 95 samples of atypical lymphocyte more than 3% from clinic pediatrics， detected the level of CMV-IgM， CMV-IgG， EBV-IgM and EBV-IgG by ELISA， analyzed the copies of CMV-DNA and EBV-DNA with real time PCR， and the peripheral blood smears were stained by Wright-Giemsa. Results There were 1.1% CMV-IgM， 5.3% EBV-IgM， 52.6% CMV-IgG and 31.6% EBV-IgG positive were discovered in 95 children patients of atypical lymphocyte increased by ELIAS， 17.9% CMV-DNA and 22.1% EBV-DNA were confi rmed by PCR， respectively. 30% CMV-DNA positive patients were found at 50 samples with CMV-IgG； 36.7% EBV-DNA were found at 30 cases with EBV-IgG. There was only one EBV-DNA negative in 5 casws with EBV-IgM. Conclusion Results showed that atypical lymphocyte increased has correlation with CMV-DNA， EBV-DNA， CMV-IgG and EBV-IgG， it will provide a clinical reference for the diagnosis and treatment of CMV and EB infection.

Atypical lymphocyte CMV EBV

浙江省科技廳錢江人才項目（2013R10072）； 浙江省自然科學基金（LY14H160037）

310012 浙江中醫藥大學附屬第一醫院（章浙忠 駱豐 楊嘯曉）310053 浙江中醫藥大學醫學技術學院（許健）*通訊作者