熒光光譜法研究奧沙利鉑與溶菌酶的相互作用

陳晨，張洪峰，王樂，魏亞超

河北省邯鄲市中心醫院藥學部，河北 邯鄲 056001

奧沙利鉑(oxalip latin)是第三代鉑類化合物，它對大腸癌、非小細胞肺癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤細胞株，包括對順鉑和卡鉑的耐藥株均有顯著的抑制作用[1]。

為了使抗癌藥物能定位于腫瘤組織釋放而減少對正常組織帶來的毒副反應，選擇蛋白質為藥物載體的應用日益廣泛[2]。溶菌酶(lysozyme，LYSO)是生物體內重要的非特異性體液免疫因子，具有抗菌、抗病毒、抗腫瘤、增強免疫力等多種藥理作用[3]，能和許多外源性和內源性物質結合，運載多種藥物。

本文主要采用熒光光譜法研究了奧沙利鉑與LYSO的相互作用，建立結合的體外模型，探討結合的緊密程度、結合模式、結合部位等問題，所得結果將為藥物的聯用以及抗腫瘤藥物靶向載體的選擇提供有利的信息。

1 材料和方法

1.1 儀器和試劑 熒光光譜儀(LS-50B型)；TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)；pH計(pHSJ-5實驗室pH計，上海精科)；CU600電熱恒溫水浴箱(上海益恒實驗儀器有限公司)。

緩沖溶液為p H=7.4，0.05m o l·L-1的T r i s-HCl(內含0.1 mol·L-1的NaCl)；LYSO(國藥集團化學試劑有限公司)1×10-5m o l·L-1，奧沙利鉑標準品(中國藥品生物制品檢定所，批號：100584-200401)1×10-3mol·L-1，均用上述緩沖溶液配制。其余試劑均為分析純，實驗用水為雙蒸水。

1.2 實驗方法

1.2.1 熒光光譜測定方法 在一系列10mL容量瓶中，加入1m L1×10-5mol·L-1的LYSO溶液和不同量的(0、10、20、30、40、50、60μL)1.0×10-3mol·L-1的奧沙利鉑溶液，用Tris-HCl緩沖溶液定容至刻度，搖勻、靜置。

熒光發射光譜：準確移取3m L含有不同濃度奧沙利鉑的LYSO溶液于石英比色皿中，在298K和310K條件下，分別掃描其熒光發射光譜。以280nm為激發波長(λex)，激發和發射狹縫均為7nm，掃描范圍300～420nm。

同步熒光光譜：Δλ=15 nm和Δλ= 60 nm，掃描范圍分別為270～315 nm和250～315 nm。

1.2.2 紫外光譜測定方法 掃描300～420nm范圍內，1.0×10-6mol·L-1的奧沙利鉑溶液的紫外吸收光譜。

2 結果

2.1 熒光光譜特征 LYSO由129個氨基酸殘基組成，Trp62和Trp108是LYSO熒光的主要來源[4]。圖1是含有不同濃度奧沙利鉑的LYSO溶液的熒光發射光譜，從圖中可以看出，隨著奧沙利鉑濃度的增加，LYSO在347 nm處的熒光發射峰強度逐漸降低，且峰位置發生了明顯的紅移，表明奧沙利鉑與LYSO發生了相互作用，LYSO的內源性熒光產生猝滅。

2.2 熒光猝滅機理 根據猝滅機理不同，熒光猝滅分為動態猝滅和靜態猝滅，分別遵循Stern-Volmer方程[1]和Lineweaver-Burk雙倒數方程[2]：

式中F0為未加入猝滅劑時LYSO的熒光強度；F為加入猝滅劑后LYSO的熒光強度；Kq為雙分子猝滅過程的速率常數；τ0為不存在猝滅劑時熒光分子的平均壽命；Ksv是動態猝滅常數；KLB是靜態猝滅常數；[Q]為猝滅劑的濃度。

以F0/F對[Q]作圖，得到不同溫度下的Ksv(表1)。對于動態猝滅，溫度升高有利于猝滅過程進行，Ksv隨溫度的升高而增大；而靜態猝滅，溫度升高形成的復合物穩定性降低，Ksv減小[5]。從表1中看出隨著溫度的升高，Ksv減小，可初步判斷猝滅過程為靜態猝滅。同時，各類猝滅劑對生物大分子的擴散碰撞猝滅常數最大不超過 2×1010L·mol-1·s-1[6]，而實驗所得Kq均遠大于此值，進一步證明奧沙利鉑與LYSO之間主要發生了靜態猝滅反應。根據Lineweaver-Burk雙倒數方程得到KLB。

2.3 結合常數和結合位點數 根據結合和自由的分子建立化學平衡方程：lg[(F0－F)/F]=lg K a+n lg[Q][3]，得出藥物與蛋白質的結合常數K a和結合位點數n，見表2，298K和310K時，奧沙利鉑與LYSO的結合位點數均接近于1，表明二者近似以1:1結合生成復合物。

圖1 奧沙利鉑與LYSO相互作用的熒光猝滅圖Fig 1 Fluorescence quenching spectra o f interaction betw een oxalip latin and LYSO C(LYSO)=1.0×10-6m o l·L-1 in all cases; Curve 1→8, C(oxalip latin)/(10-6m o l·L-1):0,1,2,3,4,5,6,7

表1 不同溫度下的K sv和K LBTab1 K sv and K LB at d ifferen t tem peratu re

表2 不同溫度下的結合常數(K a)和結合位點數(n)Tab2 Bind ing constants(K a) and binding sites(n) at d ifferent tem perature

2.4 非輻射能量轉移 根據 F?ster's能量轉移原理，如果供能體能夠發熒光，其熒光發射光譜與受能體的吸收光譜有足夠的重疊，并且供能體與受能體的最大距離小于7nm，就可認為供能體與受體之間發生了非能量輻射轉移，導致供能體熒光猝滅。臨界能量轉移距離(R0)、結合距離(r)及能量轉移效率(E)符合以下關系[7]：

F(λ)為供能體在波長λ處的熒光強度，ε(λ)為受能體在λ處的摩爾吸光系數，J是供能體熒光發射光譜與受能體紫外吸收光譜的重疊積分。偶極空間取向因子K2=2/3，LYSO中色氨酸殘基的量子產率Φ=0.15，介質折射指數n=1.36。計算得出r=4.53nm，小于7nm。由此推斷奧沙利鉑與LYSO之間發生了非輻射能量轉移，促使了LYSO的熒光猝滅。圖2為奧沙利鉑的紫外吸收光譜與LYSO熒光發射光譜的疊加圖。

2.5 作用力類型的確定 有機小分子與生物大分子之間的作用力類型主要有疏水作用力、靜電引力、氫鍵和范德華力等。當ΔH>0，ΔS>0時，分子間的作用力主要是疏水作用力；當ΔH<0，ΔS<0時，主要為氫鍵和范德華力；當ΔH<0，ΔS>0時，靜電引力占主導[8]。當溫度變化范圍不大時，反應焓變ΔH和熵變ΔS可以近似看做常數。根據熱力學方程：

圖2 奧沙利鉑的吸收光譜(1)與LYSO的熒光光譜(2)疊加圖Fig 2 Overlap o f the abso rp tion spectrum o f oxalip latin(1) w ith the fluorescence spectrum of LYSO(2)C(LYSO)=C(oxalip latin)= 1.0×10-6m o l·L-1

求得不同溫度下的熱力學參數，見表3。

可以看出，ΔG均小于0，即在298K和310K時奧沙利鉑與LYSO的相互作用過程都是自發進行的。ΔH<0，ΔS<0，說明奧沙利鉑與LYSO之間主要以氫鍵和范德華力相結合。

表3 不同溫度下奧沙利鉑與LYSO作用的熱力學參數Tab3 Therm odynam ic param eters of the reaction between oxaliplatin and LYSO at different tem perature

圖3 奧沙利鉑與LYSO相互作用的同步熒光光譜Fig 3 Synchronous fluorescence spectra of interaction betw een oxalip latin and LYSO Δλ=15nm(A)andΔλ=60nm(B)T=298 K, C(LYSO)=1×10-6m ol·L-1 in all cases; Curve 1→7, C(oxalip latin)/(10-6m o l·L-1): 0,1,2,3,4,5,6.

2.6 同步熒光光譜 Δλ=15nm和Δλ=60nm分別體現蛋白質酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特征。氨基酸殘基的最大發射波長與所處環境極性密切相關[9]，根據最大熒光發射波長的改變可判斷蛋白質構象的變化。由圖3可以看出，隨著奧沙利鉑濃度的增大，LYSO色氨酸和酪氨酸殘基的熒光發射峰均產生紅移，說明微環境的疏水性降低，肽鏈的伸展程度可能增強，氨基酸殘基處于更“暴露”的狀態中[10]，從而引起了LYSO構象的變化。

3 討論

LYSO普遍存在于鳥類、家禽的蛋清和哺乳動物的眼淚、唾液、血液、尿液、乳汁和組織細胞中[11]，是一種天然的無毒副作用的小分子堿性蛋白質，奧沙利鉑能與其以氫鍵和范德華力結合生成復合物，選擇LYSO作為奧沙利鉑的靶向載體，可能會減小其對正常組織的毒副作用，增強抗腫瘤療效。同時，二者的Ka較小，在血液中較容易分離，奧沙利鉑較容易分布到靶組織以及代謝。

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