質譜儀在真菌鑒定中的應用與評價

王歡，賈天野，鮑春梅，張成龍，張鞠玲，崔恩博，陳素明，徐東平，曲芬

質譜儀在真菌鑒定中的應用與評價

王歡，賈天野，鮑春梅，張成龍，張鞠玲，崔恩博，陳素明，徐東平，曲芬

目的探討質譜儀在真菌感染中的應用，評價其鑒定真菌的能力。方法選取分離自我院住院患者的真菌菌株327株，用質譜儀進行快速鑒定，并與VITEK-2（酵母樣真菌）和顯微鏡檢查（絲狀真菌）的鑒定結果進行比對，差異結果用分子生物學方法確認鑒定。結果依照質譜儀評分標準，227株酵母樣真菌在種水平（>2.0）的鑒定率為90.31%，在屬水平（>1.7）為98.68%；絲狀真菌在種水平的鑒定率為74.00%，在屬水平為94.00%。對臨床常見的曲霉菌鑒定正確率可達96.74%。結論質譜儀在鑒定真菌的種屬水平上都達到了令人滿意的結果，尤其鑒定酵母菌和曲霉菌的能力更為突出，可作為臨床實驗室的常規檢測方法。

光譜法，質量，基質輔助激光解吸電離；真菌；感染

近年來，隨著廣譜抗菌藥物的廣泛應用、器官移植以及導管技術的開展，腫瘤患者和接受免疫抑制劑治療者逐年增多，真菌感染（如假絲酵母菌屬、隱球菌屬和曲霉屬等）成為危及這類患者健康的主要因素之一。很多真菌生長緩慢，傳統的培養鑒定方法所需時間較長，一般為3～10 d，給早期診斷和針對性治療帶來困難，導致真菌感染死亡率升高[1]。目前，多數臨床實驗室仍采用傳統的鑒定方法進行真菌鑒定，但真菌的出現日益多樣化，使鑒定真菌病原體難度不斷增大，傳統鑒定方法已顯不足，尤其對不常見的疑難真菌[2]。基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜是近年來新興的菌種鑒定技術，可通過直接檢測生物標志物（蛋白）鑒定病毒、細菌、真菌及分枝桿菌[3-6]，具有高敏感性、高通量和快速的特點。為探討質譜儀在真菌感染診斷中的應用，評價其鑒定真菌的能力，特進行以下實驗。

1 材料與方法

1.1 材料從2011年1月—2014年12月分離自我院住院患者的真菌菌株中選取227株酵母樣真菌和100株絲狀真菌進行實驗。

1.2 試劑和儀器

1.2.1 試劑主要為沙保弱瓊脂平板（Oxoid公司，英國）、PDA培養基（Oxoid公司，英國）、需氧培養瓶（北京伯泰生物技術有限公司）、酵母菌鑒定卡（法國生物梅里埃股份有限公司）、棉藍染色液（珠海貝索生物技術有限公司）、HCCAα-氰基-4-羥基肉桂酸（布魯克公司，德國）、無水乙醇、乙腈及甲酸（Fisher Scientific，美國）、ITS4（華大基因）、ITS5（華大基因）、Premix Taq Version 2.0（TaKaRa，日本）、玻璃珠法柱式真菌DNAout（北京天恩澤基因科技有限公司）、Regular Agarose G-10（Biowest，西班牙）、50×TAE（北京索萊寶科技有限公司）、90mm平板（江蘇康健醫療用品有限公司）、1.5ml離心管（Axygen，美國）、15ml離心管（浙江拱東醫療科技有限公司）和PCR管（Axygen，美國）。

1.2.2 儀器主要有質譜儀Microflex（布魯克公司，德國）、VITEK-2全自動鑒定儀（法國生物梅里埃股份有限公司）、電熱恒溫培養箱（上海一恒科技有限公司）、霉菌培養箱（寧波江南儀器廠）、高速離心機（Thermo，美國）、PCR儀（BIO-RAD，美國）、電泳儀（BIO-RAD，美國）和凝膠成像系統（BIO-RAD，美國）。

1.3 培養將菌株接種于沙保弱瓊脂平板上，酵母樣真菌置于35℃孵箱培養24～48 h，絲狀真菌置28℃孵箱培養48 h。

1.4 真菌鑒定

1.4.1 酵母樣真菌

1.4.1.1 質譜儀鑒定將1μl菌落加在300μl無菌蒸餾水中懸浮，再加入900μl無水乙醇混勻，將樣品高速離心（13 000 r/min）2min，棄去上清液；在沉淀中加入70%甲酸50μl和乙腈50μl充分混勻，將樣品再高速離心2min；將1μl上清點在MALDI靶板上，干燥后覆蓋1μl基質溶液（飽和α-氰基-4-羥基肉桂酸、50%乙腈和2.5%三氟酸溶液），在室溫下結晶風干，用質譜儀進行鑒定。使用FlexControl3.0軟件采集圖譜，采用氮基光源及線性陽離子檢測模式，加速電壓20 kv，延遲提取電壓16.80 v，延遲時間為130 ns，激光發射電壓2500mv,激光頻率為40Hz，每個靶點設激光隨機射擊100個點，每次射擊5次，m/z的采集范圍為2～20 kDa[7-8]。用MALDIBiotyper 3.0系統進行數據庫比對，得出鑒定結果。每株菌點3個靶點，進行平行檢測，取評分最高的點計入數據統計。

1.4.1.2 VITEK-2鑒定用無菌棉簽挑取純培養的酵母樣菌落，混懸于0.45%的Nacl溶液中，配成1.8～2.2McF，用酵母菌鑒定卡（YST）按照VITEK-2全自動鑒定儀操作步驟進行鑒定。

1.4.2 絲狀真菌

1.4.2.1 質譜儀鑒定用在蒸餾水中浸濕的無菌拭子，刮取培養48 h的絲狀真菌菌落，在300μl蒸餾水中懸浮，菌液渾濁后再加入900μl無水乙醇混勻，將樣品高速離心2min，棄去上清液，在孵箱中干燥2min；在沉淀中加入70%甲酸100μl和乙腈100μl充分混勻，將樣品再高速離心2min。后續操作步驟同1.4.1.1。

1.4.2.2 顯微鏡檢查將絲狀真菌點種在PDA培養基上培養3 d，用透明膠帶粘取絲狀真菌表面，置于滴有棉蘭染液的玻片上，在顯微鏡下觀察孢子和分生孢子的形態、生長方式及菌絲特征等進行形態學鑒定[9]。

1.4.3 真菌陽性瓶鑒定初步涂片確定為真菌的胸腹水及引流液標本陽性培養瓶，吸取10ml陽性瓶中液體或絲狀真菌的菌團，放入15ml離心管中3500 r/min離心10min，將沉淀轉移到1.5ml離心管中，加入1ml蒸餾水，充分混勻后高速離心2min，棄去上清液。沉淀按照上述質譜儀鑒定的方法進行操作。

1.4.4 分子生物學鑒定真菌菌株按照玻璃珠法柱式真菌DNAout試劑盒操作方法提取DNA，選擇真菌鑒定通用引物ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC），ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG）進行擴增[10]。PCR反應體系參照Premix試劑說明書配制。擴增后的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后在凝膠成像系統上觀察是否有條帶。目的片段進行雙向測序，將測序拼接結果利用BLAST進行比對，確定鑒定結果。

1.5 統計學處理用Excel2003軟件建立數據庫，用描述性統計學方法進行分析，計算相應的發生率。

2 結果

2.1 酵母樣真菌227株酵母樣真菌質譜鑒定結果為：白假絲酵母菌70株，克柔假絲酵母菌32株，熱帶假絲酵母菌35株，光滑假絲酵母菌46株，近平滑假絲酵母菌10株，季也蒙假絲酵母菌6株，角膜假絲酵母菌4株，葡萄牙假絲酵母菌9株，新型隱球菌6株，似平滑假絲酵母菌2株，擬平滑假絲酵母菌1株，乳酒假絲酵母菌2株，挪威假絲酵母菌1株，阿薩希毛孢子菌1株，未出結果2株，其中鑒定錯誤1株。質譜儀鑒定結果與VITEK-2鑒定結果比對，發現有21株有差異，經分子生物學方法確定20株與質譜結果相同，1株與VITEK-2結果相同。質譜未出結果的菌中1株為皺褶假絲酵母菌，1株為季也蒙假絲酵母菌，將1株奧默柯達菌錯誤鑒定為季也蒙假絲酵母菌。總體鑒定率為98.68%（224/227）。質譜未鑒定出的1株季也蒙假絲酵母菌，VITEK-2鑒定正確，其鑒定率為90.31%（205/ 227）。質譜鑒定正確率高于VITEK-2。質譜與VITEK-2的鑒定結果比對見表1。

根據質譜說明書判斷結果，標準為評分＞2.0在種水平可信，1.7～2.0在屬水平可信。226株酵母樣真菌（不包含鑒定錯誤的1株菌）的質譜評分結果見表2，達到種水平的鑒定率為90.31%（205/ 227），達到屬水平為98.68%（224/227）。

表1 酵母樣真菌鑒定結果比對（株）Table 1 Comparison of the results of the identification of yeast-like fungi(strains)

表2 酵母樣真菌的質譜鑒定評分結果（株）Table 2 Scores of the identification of yeast-like fungi by mass spectrometry(strains)

2.2 絲狀真菌質譜鑒定臨床分離的絲狀真菌共100株，鑒定結果為煙曲霉菌70株，黃曲霉菌15株，黑曲霉菌5株，白地霉菌1株，茄病鐮刀菌1株，米曲霉菌2株，青霉菌3株，未出結果3株，分別為總狀毛霉菌、粗糙脈孢菌和棘孢木霉。經傳統方法鑒定和分子生物學方法驗證后，有3株鑒定錯誤，鑒定率為94.00%（94/100），曲霉菌的鑒定正確率為96.74%（89/92）。見表3。

質譜鑒定結果評分＞2.0的為74株，1.7～2.0為20株，達到種水平的鑒定率為74.00%（74/100），達到屬水平為94.00%（94/100）。97株絲狀真菌（不包含鑒定錯誤的3株菌）的質譜評分結果見表4。

表3 絲狀真菌鑒定結果比對（株）Table 3 Comparison of the results of the identification of filamentous fungi(strains)

表4 絲狀真菌質譜評分結果（株）Table 4 Scores of the identification of filamentous fungi by mass spectrometry(strains)

2.3 真菌質譜圖譜不同真菌圖譜中的特異峰不同（圖1）。

圖1 部分酵母樣真菌質譜圖Figure 1 M ass spectrum of yeast-like fungi

2.4 真菌陽性培養瓶的鑒定本實驗從初步涂片確定為真菌的陽性培養瓶中直接提取菌種蛋白，用質譜儀進行鑒定。實驗8例，除1例為混合感染未提取到有效菌種蛋白鑒定失敗，其余7例均與培養后鑒定結果一致，菌種類別分別為白假絲酵母菌4株，黃曲霉菌1株，近平滑假絲酵母菌1株，光滑假絲酵母菌1株。

2.5 鑒定用時質譜儀可在菌種鑒定當日得出結果，平均用時20min；VITEK-2鑒定酵母樣真菌需要24～48 h，絲狀真菌鑒定需要在PDA培養基上培養3 d才能在鏡下看到理想的形態；分子生物學方法需經過測序得到鑒定結果，也要經過24～48 h。所以質譜儀是目前真菌鑒定方法中用時最短，操作也相對簡便的方法。

3 討論

真菌感染已成為臨床抗感染治療的棘手問題，早期、快速、準確的診斷是及時救治的關鍵[11]。全球每年約有7280萬例假絲酵母菌感染；在美國，假絲酵母菌感染是院內血流感染致死的重要因素，其中白假絲酵母菌成為最重要的致病真菌[2]。目前，臨床常用的酵母樣真菌鑒定方法有科瑪嘉顯色培養法、VITEK-2和API AUX鑒定法，對常見酵母樣真菌（白假絲酵母菌、克柔假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌和熱帶假絲酵母菌）的鑒定正確率可達到92%～96%[12]，但對某些酵母樣真菌鑒定準確度低，如不能準確鑒定格特隱球菌[13]。鑒定絲狀真菌常采用PDA培養后，顯微鏡鏡下觀察形態特點和產孢方式，并結合菌落生長形態和顏色等，要求檢驗人員有豐富的絲狀真菌鑒定經驗，易產生人為誤差，且操作時對環境易造成污染。分子生物學方法是目前公認的“金標準”[9]，但其操作步驟繁瑣，單株菌的前處理需1 h，鑒定需24～48 h，對操作人員的要求高，易受到污染導致鑒定失敗。

質譜技術是近年研究的熱點，以高通量、快速、準確等優點受到微生物實驗室的關注。不同菌的蛋白表達不同，通過質譜儀得到的蛋白質圖譜也不同，將待測菌的蛋白圖譜和數據庫進行比對，根據圖譜的匹配度，得出鑒定結果和相應的鑒定分值，分值越高匹配度越好，結果越可信。本研究用質譜儀對臨床分離的14個種的227株酵母真菌進行鑒定，按照質譜評分標準，鑒定分值達到種水平（評分＞2.0）的為90.31%（205/227），達到屬水平（評分＞1.7）為98.68%（224/227），與國內外報道基本一致[2，14-15]。絲狀真菌鑒定評分達到種水平的為74.00%（74/100），達到屬水平為94.00%（94/100）。由此可見，質譜儀在鑒定酵母菌上優勢更突出。經過與傳統鑒定方法的結果比對以及分子生物學方法對結果的確認，我們發現質譜鑒定評分＞1.7的結果，作為臨床真菌種水平的診斷準確性也較高，在今后的研究中將繼續評價。目前質譜MALDIBiotyper 3.0系統中有178種酵母樣真菌的圖譜，但仍缺少個別種類，如本研究中鑒定錯誤的奧默柯達菌。國外有研究生物梅里埃的Vitek MS系統，對奧默柯達菌的鑒定正確率為90.9%[16]，可見質譜數據庫的完善程度直接影響其鑒定能力。有文獻統計質譜儀對以下絲狀真菌鑒定效果較好，包括曲霉菌、青霉菌、毛癬菌、鐮刀菌、木霉和毛霉目[12]，特別是臨床常見的曲霉菌。本研究中曲霉菌的鑒定正確率達到96.74%（89/ 92），與國外報道相似[6]，可替代臨床實驗室曲霉菌的傳統鑒定方法。絲狀真菌的數據庫圖譜較少，這為實驗室提供了更大的拓展空間，實驗室可根據自己的特點，建立個性化的數據庫，提高檢測效率和準確性。

隨著真菌研究的深入，發現真菌表型分類存在局限性，應用分子生物學技術從遺傳和進化角度進行分類是目前真菌分類的方向[4]。例如近平滑假絲酵母菌通過基因分型可分為近平滑假絲酵母菌、似平滑假絲酵母菌和擬平滑假絲酵母菌3組，而且三者之間對藥物的敏感性存在差異，特別是棘白菌素抗真菌藥[17-18]。這表明物種鑒定可能對治療產生影響。本研究中對2株似平滑假絲酵母菌和1株擬平滑假絲酵母菌，質譜儀都進行了準確的鑒定，而VITEK-2未鑒定出結果。Quiles-Melero等[19]對77株臨床分離的近平滑假絲酵母菌復合群進行了質譜分型，并用分子生物學方法進行了驗證，符合率為100%，提示通過質譜儀可以對近平滑假絲酵母菌復合群進行準確的種內分型，以便更好地指導臨床用藥。

本研究通過對現有各種真菌鑒定方法用時的比較，發現質譜儀單株真菌鑒定用時僅需20min，并且可同時檢測多株菌，是目前用時最短、操作也較簡便的方法，實驗室人員經過培訓都可獨立操作，人為誤差較小。布魯克公司雖然已有檢測陽性血培養的成品試劑盒Bruker Sepsistyper問世，但價格較高，標本只局限于血培養。國外有報道稱不能直接從體液中直接檢測真菌，必須通過前期的分離培養[20]。本研究初步發現，培養瓶中真菌只要為單一種類，質譜鑒定可以得到滿意的結果。此方法可將體液真菌感染的鑒定時間提前24 h，為臨床治療爭取了時間。

質譜儀在鑒定真菌的種屬水平上都達到了滿意的結果，尤其鑒定酵母樣菌和曲霉菌的能力更為突出，大大縮短臨床微生物鑒定的時間，且滿足真菌檢測的需求，可作為實驗室檢測真菌的常規方法。

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（2015-05-15收稿 2015-06-23修回）

（責任編委 辛紹杰 本文編輯 陳玉琪）

Application and evaluation ofmass spectrometry in identification of fungal infection

WANG Huan,JIA Tian-ye,BAO Chun-mei,ZHANG Cheng-long,ZHANG Ju-Ling,CUIEn-bo, CHEN Su-ming,XU dong-ping*,QU Fen*
Postgraduate Squad,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100036,China
*Corresponding author.XU dong-ping,E-mail:xudongping302@sina.com;QU Fen,E-mail:qf302@163.com

Objective To investigate the application ofmass spectrometry to the fungal infection,and to evaluate its ability to identify fungal infection.M ethods Totally 327 strains of fungi isolated from the inpatients admitted to our hospitalwere selected,and identified by matrix-assisted laser desorption ionization-time of flightmass spectrometry(MALDI-TOFMS).The resultswere then compared with those of the identification by VITEK-2(yeast-like fungi)andmicroscope(filamentous fungi).Molecular biologymethods were used to confirm the identification.Results The results of the identification by MALDI-TOFMSshowed that identification rate of yeast-like fungiatspecies level(score>2.0)was90.31%,and thatat the genus level(score>1.7)was98.68%;identification rate of filamentous fungiatspecies levelwas 74.00%,and thatat the genus levelwas 94.00%.The accuracy of identification of Aspergillus could reach 96.74%.Conclusions Fungalspecies can bewell identified byMALDI-TOFMS,especially yeastsand Aspergillus.The identification by MALDI-TOFMScan be used as routine detectionmethod for clinical laboratory.

spectrometry,mass,matrix-assisted laserdesorption-ionization;fungi;infection

R379

A

1007-8134(2015)04-0210-05

10.3969/j.issn.1007-8134.2015.04.006

首都衛生發展科研專項基金（2011-4001-9）

100036北京，軍事醫學科學院研究生隊（王歡）；100039北京，解放軍第三〇二醫院臨床檢驗醫學中心（王歡、賈天野、鮑春梅、張成龍、張鞠玲、崔恩博、陳素明、曲芬），肝衰竭診療與研究中心（徐東平）

徐東平，E-mail:xudongping302@sina.com；曲芬，E-mail: qf302@163.com