當歸紅芪超濾物對過氧化氫致內皮細胞凋亡中熱休克蛋白70及內皮型一氧化氮合酶表達的影響

顧麗娟等

摘要：目的 探討當歸紅芪超濾物對過氧化氫（H2O2）致內皮細胞凋亡中熱休克蛋白70（HSP70）及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）表達的影響。方法 H2O2誘導ECV-304人臍靜脈內皮細胞凋亡制備模型，實驗分為正常對照組、模型組、單純藥物組、藥物干預組，并給予相應藥物干預，流式細胞儀檢測細胞凋亡及細胞內Ca2+濃度，RT-PCR法檢測HSP70、eNOS的基因表達，蛋白印跡法檢測HSP70的蛋白表達，硝酸還原酶法及分光光度法檢測一氧化氮（NO）的含量。結果 與正常對照組比較，模型組細胞凋亡率明顯增加、細胞內Ca2+濃度明顯上升（P<0.05），細胞HSP70基因和蛋白表達上調、eNOS基因表達下調及NO含量降低（P<0.05）；與模型組比較，藥物干預組細胞凋亡率、細胞內Ca2+濃度明顯降低（P<0.05），細胞HSP70基因和蛋白表達上調、eNOS基因表達上調及NO含量升高（P<0.05）。結論 當歸紅芪超濾物通過上調HSP70、eNOS的表達及NO含量，降低細胞內鈣超載，發揮抗H2O2致ECV-304人臍靜脈內皮細胞凋亡的作用。

關鍵詞：當歸紅芪超濾物；過氧化氫；人臍靜脈內皮細胞；細胞凋亡

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.015

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）04-0051-04

Effects of Ultra-filtration Extract from Angelicae Sinensis Radix and Hedysarum Polybotrys on Expressions of HSP70 and eNOS in H2O2-induced Endothelial Cell Apoptosis GU Li-juan， LIU Kai， SUN Shao-bo， LIU Guo-an， LI Ying-dong （Gansu University of Chinese Medicine， Lanzhou 730000， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of ultra-filtration extract from the mixture of Angelicae Sinensis Radix and Hedysarum Polybotrys （UFE-AH） on the expressions of HSP70 and eNOS in H2O2-induced endothelial cell apoptosis. Methods H2O2 induced ECV-304 cell apoptosis to prepare models. The experiment was divided into normal control group， model group， simple medicine group， medicine intervention group， and all treatment groups received relevant medicine for intervention. Flow cytometry （FCM） was used to detect apoptosis and concentration of intracellular Ca2+；RT-PCR was used to detect the mRNA expression of HSP70 and eNOS；Western blot was used to detect the expression of HSP70 protein；Nitrale reduetase and spectrophotometric method were employed to detect the content of NO. Results Compared with normal control group， cell apoptosis rate， concentration of intracellular Ca2+， and expression of HSP70 increased significantly in model group （P<0.05）；gene expression of eNOS mRNA and content of NO decreased （P<0.05）. Compared with model group， cell apoptosis rate and concentration of intracellular Ca2+ dropped in medicine intervention group （P<0.05）；expressions of HSP70， eNOS mRNA and content of NO increased （P<0.05）. Conclusion UFE-AH can confront H2O2-induced cell apoptosis H2O2 of ECV-304 human umbilical vein endothelial by increasing the expressions of HSP70 and eNOS and content of NO， and reducing the intracellular calcium overload.

Key words：UFE-AH；H2O2；human umbilical vein endothelial cell；cell apoptosis

基金項目：甘肅省自然科學研究基金計劃（1010RJZA174）

通訊作者：劉凱，E-mail：xubo_l@163.com

內皮細胞損傷是常見心腦血管疾病的始發因素，氧化損傷是主要原因及機制之一，防治內皮細胞損傷可使心腦血管病患者獲益。研究表明，多種中藥具有抗氧化損傷作用，提示其對內皮細胞的氧化損傷具有拮抗作用[1]。本課題組前期研究表明，益氣補血中藥當歸、紅芪（1∶5）配伍后經超濾技術提取的有效組分具有抗氧化、改善心肌缺血等功效[2-5]。本實驗旨在研究0～10萬分子量范圍的當歸紅芪超濾物對過氧化氫（H2O2）致ECV-304人臍靜脈內皮細胞損傷后細胞凋亡率、鈣超載、熱休克蛋白70（HSP70）及內皮型一氧化氮合酶（eNOS）基因表達的影響，為其在臨床防治心腦血管疾病的推廣應用提供實驗依據。

1 實驗材料

1.1 藥物

當歸采自甘肅岷縣，紅芪采自甘肅宕昌，經甘肅中醫學院生藥學教研室鑒定為傘形科當歸屬Angelica Sinensis （Oliv.）Diels的根和豆科紅花巖黃芪屬植物多序黃芪Hedysarum Polybotrys Hand.- Mazz.的干燥根莖。按比例配伍，經水煎，微濾，超濾，噴霧干燥等工藝制備，參照文獻[6]，由甘肅中醫學院、甘肅膜科學技術研究院及蘭州佛慈制藥股份有限公司聯合制備藥物。高效液相色譜法檢測指紋圖譜進行質量控制[樣品用50%甲醇溶解，微波助溶， Inertsil ODS-SP G8色譜柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），檢測波長275 nm，甲醇-0.1%磷酸水溶液，梯度洗脫（0～20 min，3∶97；20～40 min，20∶80；40～50 min， 60∶40；50～60 min，90∶10）]。

1.2 細胞

人臍靜脈內皮細胞系ECV-304細胞，購自中國典型培養物保藏中心（編號GDC023）。

1.3 主要試劑與儀器

DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶：GIBCO公司；過氧化氫：天津市富宇精細化工有限公司，批號20130331；總RNA抽提試劑盒、RT-PCR反應試劑盒：生工生物工程（上海）有限公司；Maker：1000 bp DNA ladder，大連寶生物有限公司；HSP70、eNOS基因引物：南京金斯瑞生物科技有限公司合成；Fluo-3試劑盒：美國Sigma公司；AnnexinⅤ/PI細胞凋亡試劑盒：Invitrogen公司；兔抗鼠Hsp70、β-actin多克隆抗體：Santa Cruz公司；辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG：武漢博士德生物工程有限公司；一氧化氮（NO）試劑盒：南京建成生物工程研究所。XL型流式細胞儀：美國Coulter公司；PE2400型PCR擴增儀：美國PE公司；BTS-20.M型凝膠成像分析系統：Uvitec公司產品；DYCP31A型電泳槽、HV-3000型電泳儀：北京市六一儀器廠。

2 實驗方法

2.1 造模與分組

參照文獻[7]方法。將ECV-304人臍靜脈內皮細胞按1.0×l05個/mL密度接種，配制含10%胎牛血清，青霉素、鏈霉素各100 U/mL的低糖DMEM完全培養基，37 ℃、5%CO2培養箱中常規培養，每隔1.5 d換液。200 μmol/L H2O2誘導心肌細胞凋亡。實驗分為正常對照組（完全培養基中加與各組等量的生理鹽水常規培養細胞32 h后換液，完全培養基中加與各組等量的生理鹽水常規培養細胞6 h）、單純藥物組（完全培養基中加終濃度6 g/L的當歸紅芪超濾物培養32 h后換液，完全培養基中加終濃度6 g/L當歸紅芪超濾物培養6 h）、模型組（完全培養基中加與各組等量的生理鹽水常規培養細胞32 h后換液，完全培養基中加終濃度200 μmol/L H2O2培養6 h）、藥物干預組（完全培養基中加終濃度6 g/L當歸紅芪超濾物培養32 h后換液，完全培養基中加終濃度200 μmol/L H2O2培養6 h）。

2.2 流式細胞儀檢測細胞凋亡

0.25%胰酶消化收集各組細胞，預冷PBS洗滌細胞，在染色緩沖液中5×105/mL重懸細胞，吸取100 μL細胞（1×105）至試管中，加入5 μL的熒光標記的Annexin V試劑和3 μL碘化丙啶，混勻后避光室溫孵育15 min，孵育后加入400 μL染色緩沖液，流式細胞儀檢測。

2.3 流式細胞儀檢測細胞內Ca2+含量

常規消化、離心、收集各組細胞，用冷PBS洗滌細胞，加2 mL細胞孵育液、1 mmol/L Fluo3-AM 8 μL， 30 ℃水浴孵育20 min，洗滌細胞2次后懸浮細胞，于激發波長506 nm、發射波長526 nm，測定熒光值F。加入100 μL含20%Triton X-100和20 mmol/L CaCl2溶液100 μL，測得Fmax，再加pH 7.0 200 mmol/L EGTA 100 μL，測得Fmin。[Ca2+]=Kd[（F-Fmin）/（Fmax-F）]，其中Kd=0.40 μmmol/L。

2.4 RT-PCR法檢測熱休克蛋白70及內皮型一氧化氮合酶基因的表達

常規消化、離心、收集各組細胞，按試劑盒說明提取總RNA。根據文獻選用特異性引物[7-8]。HSP70上游引物：5'-AAGGTGGAGATCATCGCCAA-3'，HSP70下游引物：5'-GCGATCTCCTTCTTCATCTTGGT-3'；eNOS上游引物：5'-CAAGTTCCCTCGTGTGAAGAACTG-3'，eNOS下游引物：5'-GAGCTGTAGTACTGGTTGATGAAGTC-3'；β-actin上游引物：5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3'，β-actin下游引物：5'-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3'。產物長度：HSP70 300 bp，eNOS 214 bp，β-actin 302 bp。根據RT-PCR反應試劑盒說明及參考文獻設定反應條件進行反轉錄與PCR擴增。各組取10 μL擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠圖像成像系統分析各條帶的光密度，以目的基因條帶與內參基因（β-actin）條帶的光密度比值計算相對表達量。

2.5 蛋白印跡法檢測熱休克蛋白70的蛋白表達

收集各組細胞，PBS洗滌，裂解細胞提取總蛋白，考馬斯亮藍法繪制標準曲線，測定蛋白濃度。每組各取50 μL蛋白，經SDS PAGE電泳后轉至PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，分別加HSP70，β-actin抗體4 ℃孵育過夜，加辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG于37 ℃孵育1 h，加ECL發光試劑孵育1 min，暗室將膜在感光膠片上曝光，加顯影液，定影液洗像。用Alpha Imager 2200圖像分析系統進行灰度掃描，計算HSP70與β-actin灰度比值。

2.6 一氧化氮含量測定

按試劑盒說明書操作，應用硝酸還原酶法及分光光度法測定各組細胞培養上清液中NO含量。

3 統計學方法

采用SPSS11.5統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，組間計量資料采用方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

4 結果

4.1 當歸紅芪超濾物對過氧化氫致內皮細胞早期凋亡的影響

D1象限代表細胞收集過程中機械損傷細胞碎片；D2象限代表晚期凋亡與壞死細胞；D3象限代表正常細胞；D4象限代表早期凋亡細胞。與正常對照組比較，模型組早期凋亡細胞百分率均明顯上升、正常細胞百分率明顯下降（P<0.05），單純藥物組早期凋亡細胞百分率有下降趨勢、正常細胞百分率有上升趨勢；與模型組比較，單純藥物組、藥物干預組正常細胞百分率明顯上升、早期凋亡細胞百分率明顯下降（P<0.05）。結果見表1。

4.2 當歸紅芪超濾物對過氧化氫致內皮細胞鈣超載的影響

與正常對照組比較，模型組細胞內Ca2+濃度明顯上升（P<0.05）；與模型組比較，藥物干預組細胞內Ca2+濃度明顯下降（P<0.05）。結果見表2。

4.3 當歸紅芪超濾物對過氧化氫致損傷內皮細胞熱休克蛋白70、內皮型一氧化氮合酶基因表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞HSP70 mRNA表達明顯上升、eNOS mRNA表達明顯下降，單純藥物組細胞eNOS mRNA表達有增高的趨勢；與模型組比較，藥物干預組細胞HSP70、eNOS mRNA表達明顯上升（P<0.05）。結果見表3、圖1。

4.4 當歸紅芪超濾物對過氧化氫致損傷內皮細胞熱休克蛋白70蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組細胞內HSP70蛋白表達明顯上升（P<0.05）；與模型組比較，藥物干預組細胞內HSP70表達上升（P<0.05）。結果見表4、圖2。

4.5 當歸紅芪超濾物對過氧化氫致損傷內皮細胞一氧化氮含量的影響

與正常對照組比較，模型組NO含量明顯下降，單純藥物組NO含量明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，單純藥物組、藥物干預組NO含量明顯升高（P<0.05）。結果見表5。

5 討論

H2O2損傷細胞是經典的細胞學氧化損傷模型。H2O2作用于人臍靜脈內皮細胞，產生的活性氧引起細胞脂質過氧化，膜轉運功能異常，離子轉運異常，細胞內鈣超載，異常升高的Ca2+造成脂質過氧化，激活磷酸酶、蛋白酶及細胞骨架的改變，形成惡性循環，誘導細胞凋亡。熱休克蛋白又稱應激蛋白，HSP70通過分子伴侶功能發揮細胞與臟器保護作用。作為分子伴侶，HSP70具有明顯減輕細胞損傷的作用，也可通過多種途徑抑制凋亡的發生，對許多細胞內應激起保護作用。HSP70可通過抑制氧自由基的關鍵酶的產生，減少細胞損傷后自由基的產生；增加內源性過氧化酶水平，清除氧自由基；抑制細胞Ca2+內流，拮抗活性氧介導的鈣超載引起的細胞損傷與凋亡。eNOS是內皮功能完整性標志酶之一，eNOS是鈣依賴蛋白酶，通過催化精氨酸合成內皮源性舒張因子NO，維持血管內皮的正常生理功能。

本實驗結果顯示，H2O2可以造成離體培養的人臍靜脈內皮細胞的凋亡，在凋亡過程中細胞內出現了鈣超載，HSP70作為一種保護性蛋白其表達明顯升高，H2O2損傷影響了內皮細胞的正常生理功能，eNOS基因表達水平下降，NO合成與分泌明顯降低。當歸紅芪超濾物對H2O2引起的內皮細胞損傷有拮抗作用，具有抗H2O2致人臍靜脈內皮細胞凋亡的作用，具有減輕細胞內鈣超載，促進HSP70基因的表達、維持正常內皮細胞功能、上調eNOS表達、維持NO合成與分泌的作用。當歸紅芪超濾物單用對人臍靜脈內皮細胞具有減少自然凋亡率、eNOS基因表達、促進NO合成與分泌明顯的趨勢。本研究結果提示，當歸紅芪超濾物具有抗內皮細胞氧化損傷、維持血管內皮功能穩態的作用，對預防及治療心腦血管疾病具有積極意義。

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（收稿日期：2014-06-18；編輯：華強）