湖南漢族MMP—9基因多態性與2型糖尿病的相關性

蔣福平等

摘要：目的：探討湖南地區漢族人群中MMP-9基因單核苷酸多態性與2型糖尿病的相關性。方法：在湖南地區漢族人群中采集169例2型糖尿病患者以及166名正常糖耐量志愿者外周血，提取基因組DNA。應用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）和DNA直接測序技術鑒定MMP-9基因啟動子區C-1562-T位點的等位基因和基因型，分析等位基因頻率在不同人群中的分布及其與2型糖尿病的相關性。結果：MMP-9基因C-1562-T位點等位基因在2型糖尿病和正常糖耐量人群中的分布頻率分別為0.687、0.313和0.589、0.411（P<0.01），糖尿病人群中CC基因型比例顯著高于正常糖耐量人群（P<0.01）。結論 MMP-9基因啟動子區C-1562-T位點T等位基因及TT基因型與湖南地區漢族人群2型糖尿病的易感性密切相關。

關鍵詞：漢族；MMP-9；2型糖尿病；基因多態性

【中圖分類號】R781.6+4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1672-8602（2015）06-0098-02

前言

糖尿病（diabetes mellitus）是一種長期的慢性疾病，患者在長期的高血糖狀況下，機體代謝發生紊亂，防御機制減弱，抗感染能力降低，且多合并微循環病變[1]。2型糖尿病是糖尿病中最常見的類型，其特征為胰島素作用異常和分泌障礙，可以任其一個方面為主，確切病因還不清楚[2]。基質金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9， MMP-9）又稱為明膠酶B，是人類MMPs中分子量最大的酶，MMP-9可通過降解、破壞靠近腫瘤細胞表面的細胞外基質（extracellular matrix， ECM）和與基底膜（basement membrane， BM），促進腫瘤細胞的侵襲和轉移灶形成，在惡性腫瘤發生發展中起重要作用[3]。新近有研究提示MMP-9基因多態性也與糖尿病及糖尿病的并發癥有密切關聯[4]，為此，本研究擬初步探討MMP-9基因的單核苷酸多態性與2型糖尿病之間的相關性，現報道如下。

1 材料與方法

1.1一般資料 收集我院收治的門診或住院2型糖尿病患者169例作為患者組，均符合WHO 1999年糖尿病的診斷和分型標準，排除各種糖尿病急性并發癥，感染，嚴重肝、腎功能損害，惡性腫瘤和自身免疫性疾病。其中男性78例，女性91例；平均年齡（55.5±7.7）歲；平均病程（5.44±4.02）年。另采集162例來自我院體檢中心及市中心血站的隨機無親緣關系的正常個體作為對照組，其中男性72例，女性94例；平均年齡（46.3±9.3）歲。患者組和對照組所有個體均為連續三代以上的湖南籍漢族人。

1.2主要儀器和試劑 人全血基因組DNA提取試劑盒（北京索萊寶）；Taq DNA polymerase、dNTPMixture、10×PCR buffer、50bp DNA Ladder Marker（北京索萊寶）；瓊脂糖、限制性核酸內切酶SPH I（Biotech公司）；PCR引物合成（大連寶生物）。PCR儀（Bio-Rad MyCycler PTC240美國）；微型水平電泳槽（北京市六一儀器廠，DYY-H128B型）

1.3檢測方法 采集受試者外周靜脈血5 mL，按試劑盒說明抽提基因組DNA，所得DNA樣品用紫外分光光度計測定其260nm/280nm OD值，檢測DNA的純度和含量。PCR擴增條件：95℃ 5min預變性，95℃ 45s→69℃ 45s→72℃ 45s（30cycles），72℃ 10min。MMP-9 C-1562-T位點引物：上游：5'-GCCTGGCACArAGTAGGCCC-3'；下游：5'-CTTCCTAGCCAGCCGGCATC-3'。擴增完成后，將PCR產物酶切，酶切體系包括：PCR產物 5 μL，SPH I 1 μL，Buffer 2 μL，ddH2O 12 μL，置37℃過夜。取上述酶切產物5 μL，加入上樣緩沖液1 μL，混勻后經2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。隨機抽取20份擴增樣本基因測序（華大基因）。

1.5統計學方法 所有數據均使用SPSS 13.0軟件包進行統計學分析，組間比較采用Students t檢驗，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義的標準。

2 結果

2.1 兩組臨床資料的比較 糖尿病組組與正常對照組的年齡、性別、BMI無顯著性差異，但患者組的FPG、TG、CHO、VLDL、LDL明顯高于對照組，而HDL顯著低于正常對照組（P<0.05） （表1）。

2.2 MMP-9基因位點多態性檢測結果 采用PCR-RFLP及DNA直接測序技術能正確鑒定出MMP-9基因啟動子區C-1562-T位點的等位基因和基因型（圖1，圖2）。

2.3 兩組MMP-9基因多態性的比較 應用上述方法鑒定出所有研究對象MMP-9基因啟動子區C-1562-T位點的等位基因和基因型，并進一步統計分析后，結果發現：兩組MMP-9基因啟動子區C-1562-T位點的等位基因型CC/CT/TT的分布存在差異，患者組中的CT和TT基因型頻率顯著高于對照組（P<0.05）；兩組MMP-9基因啟動子區C-1562-T位點等位基因C/T的分布存在差異，患者組中T基因頻率顯著高于對照組（P<0.05）（表2）。

3 討論

隨著人們生活水平的提高，2型糖尿病（Type 2 Diabetes， T2D）的發病率明顯增加，嚴重影響人們的生活質量。胰島素抵抗（insulin resistance， IR）和葡萄糖刺激的胰島素分泌 （glucose stimulated insulin secretion， GSIS）受損是導致T2D發展的2個主要因素[5]。新近研究顯示認為T2D是一種自然免疫和低度炎癥性疾病，其發生發展與的炎癥反應以及胰島中的血管損傷密切相關[6]。基質金屬蛋白酶（MMPs）一類活性依賴于Zn2+的和Ca2+的內肽酶超家族，可由體內多種細胞合成和分泌，它可以降解除多糖外的所有細胞外基質成分、促進細胞增殖、新生血管形成和組織重塑等，參與體內多種病理生理過程。

國內外大量研究證實MMP-9的表達水平和活性變化與糖尿病腎病的發生和發展有關[7]。研究發現2型糖尿病患者合并腎損害時血漿中MMP-9的水平升高，并發生于微量白蛋白尿之前，認為可作為DN的早期診斷指標。但隨著尿蛋白排泄率的增加MMP-9逐漸減低，MMP-9/TIMP比值呈遞減趨勢，細胞外基質膠原降解逐漸減少，導致腎小球基底膜的增厚及細胞外基質的積聚，形成了糖尿病腎病的典型病理改變[8]。本研究采用PCR-RFLP和 DNA測序法檢測了162例正常對照和169例T2D患者的MMP-9基因C-1562-T位點的等位基因和基因型分布。結果顯示T2D患者組中C-1562-T位點T堿基出現頻率顯著高于正常對照組，這強烈提示1562-T突變與T2D的易感性相關。

糖尿病及其慢性并發癥是一種遺傳基因和內外環境綜合作用而形成的多種病理過程參與的復雜的綜合征。同一基因不同位點或序列的變異可能導致不同的影響，并且在不同的代謝因素、不同的組織器官中其轉錄和表達可能也有差異[9]。而MMP的活性變化對其不同的并發癥的病理過程有不同的影響。例如在糖尿病腎病的治療上，則需要根據其不同的發展階段中MMP的活性不同變化選擇MMP抑制或激活劑，而且在治療動脈粥樣硬化中過度抑制或激活MMPs活性均不利于動脈粥樣硬化斑塊的發展。從本研究對MMP-9基因C-1562-T位點的分析結果出發，我們認為TT基因型和T等位基因是2型糖尿病的易感基因，而CC基因型和C等位基因是其保護性基因，以此為基礎，仍需一步更為深入的研究，以探索基因之間，基因與內外環境因素之間，基因與組織器官之間復雜的交互網絡關系，揭開2型糖尿病發生和發展規律。

參考文獻

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