藁本內酯抗人肺癌A549細胞增殖作用研究

王立宏 武興斌 王利

摘要：目的 探討藁本內酯抗人肺癌A549細胞增殖的作用機制。方法 CCK-8法檢測藁本內酯對A549細胞活力的影響，TUNEL法檢測細胞凋亡率，Hoechst 33258熒光染色法觀察A549細胞的形態變化，ELISA檢測血管內皮生長因子（VEGF）含量，Western blot檢測核因子-κB（NF-κB）、Bcl-2、Bax及磷酸化JNK蛋白表達。結果 15、30、60、120、180 μmol/L藁本內酯作用12、24、48 h能抑制A549細胞活力（P<0.05，P<0.01， P<0.001），并呈劑量及時間依賴（P<0.05，P<0.01）；30、60、120 μmol/L藁本內酯作用12、24、48 h，細胞凋亡率呈時間和劑量依賴（P<0.05，P<0.01）；經藁本內酯處理48 h后，A549細胞核可見明顯凋亡形態，包括核皺縮、碎裂、亮藍色熒光，染色質分割產生凋亡小體；30、60、120 μmol/L藁本內酯細胞核內NF-κB蛋白p65亞基表達升高、細胞內JNK蛋白磷酸化水平升高、抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低及促凋亡蛋白Bax表達升高（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結論 藁本內酯通過抑制VEGF的表達而抑制腫瘤新生血管的形成，通過調控NF-κB蛋白表達及JNK蛋白磷酸化水平，降低Bcl-2/Bax比值，誘導腫瘤細胞凋亡。

關鍵詞：藁本內酯；A549細胞；凋亡；血管內皮生長因子；核因子-κB

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2015.07.016

中圖分類號：R285.5 文獻標識碼：A 文章編號：1005-5304（2015）07-0055-05

Antiproliferative Effect of Ligustilide on Human Lung Adenocarcinoma A549 Cells WANG Li-hong1，2， WU Xing-bin1， WANG Li1 （1.Pharmacy Department， Second Hospital Affiliated to Lanzhou University， Lanzhou 730030， China；2.Wuwei Peoples Hospital， Wuwei 733000， China）

Abstract：Objective To investigate the effects of ligustilide on the proliferation of human lung adenocarcinoma A549 cells and its mechanism. Methods CCK-8 method was used to detect the effects of ligustilide on activity of A549 cells. Apoptosis rate was measured by TUNEL. Nuclear morphological changes of A549 cells were observed by fluorescence microscope after staining by Hoechst 33258. ELISA was used to detect the VEGF levels after incubation with ligustilide. Western blot was used to detect the expression of NF-κB， Bcl-2， Bax and the protein expression of phosphorylation of JNK. Results A549 cell activity was significantly inhibited after incubated with 15， 30， 60， 120， 180 μmol/L ligustilide for 12， 24， 48 h （P<0.05， P<0.01， P<0.001） in a dose and time-dependent manner （P<0.05， P<0.01）；Apoptosis rate increased by 30， 60， 120 μmol/L ligustilide for 12， 24， 48 h in a dose and time-dependent manner；A549 cells treated with ligustilide for 48 h appeared the apoptosis forms， including nuclear shrinkage， beating， strong blue fluorescence staining， and the chromatin divided producing apoptotic body；30， 60， 120 μmol/L ligustilide increased the expression of p65 subunit of NF-κB protein in the nuclei and the phosphorylation levels of JNK protein， reduce the expression of suppression apoptosis protein Bcl-2， and raised the expression of pro-apoptotic protein Bax （P<0.05， P<0.01， P<0.001）. Conclusion By inhibiting the expression of VEGF， ligustilide can inhibit the formation of tumor angiogenesis. By regulating the expression of NF-κB and the phosphorylation levels of JNK protein and reducing the ratio of Bcl-2/Bax， ligustilide can promote tumor cell apoptosis.

Key words：ligustilide；A549 cells；apoptosis；VEGF；NF-κB

基金項目：甘肅省自然科學研究基金計劃（096RJZA143）

通訊作者：王利，E-mail：lzuwangli@163.com

藁本內酯是當歸、川芎等中藥中主要活性成分之一，對心腦血管、循環系統及免疫功能均有較強的藥理作用[1-2]。研究表明，藁本內酯具有抗腫瘤活性，能夠誘導腫瘤細胞凋亡，抑制腫瘤細胞的增殖、轉移及腫瘤的生長、浸潤[3-5]。本研究以肺腺癌A549細胞為模型，觀察藁本內酯誘導A549細胞凋亡的影響，并探討其作用機制，以期為臨床藁本內酯治療肺癌提供實驗數據。

1 材料與方法

1.1 藥物與細胞

藁本內酯，天津士蘭科技有限公司，純度>98%；A549細胞購自ATCC。

1.2 主要試劑與儀器

CCK-8試劑盒，上海博谷生物科技有限公司；蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、TUNEL試劑盒及人血管內皮生長因子（VEGF）ELISA試劑盒，Roche公司；Hoechst 33258試劑盒，上海依科賽生物制品有限公司；細胞核和胞質蛋白提取試劑盒，生工生物工程上海（股份）有限公司；DMSO及胎牛血清（FBS），Gibco公司；兔抗人核因子-κB（NF-κB）、磷酸化-JNK（P-JNK）、Bcl-2及Bax抗體，Santa Cruz公司。熒光顯微鏡IX51（日本Olympus公司），ELx800酶標儀（美國BioTek公司），Z-323高速低溫離心機（德國HERMLE公司），FCM流式細胞儀（美國BD）。

1.3 細胞培養

A549細胞在含10%胎牛血清和青霉素100 μg/L、鏈霉素100 μg/L的DMEM培養基中，37 ℃、5%CO2孵育。細胞貼壁生長，2～3 d傳代1次。細胞生長至對數期時開始實驗，待細胞生長至80%時，serum- starved 10 h后用于實驗。

1.4 CCK-8法檢測細胞活力

取對數生長期細胞，37 ℃預熱，PBS洗3次， 0.25%胰酶消化，制成細胞懸液，以100 μL/孔（6000 cells）接種在在96孔板中，37 ℃、5%CO2培養箱中預培養，待細胞生長至80%時，serum-starved 10 h。給予含藁本內酯15、30、60、120、180 μmol/L的無血清培養基，繼續培養12、24、48 h，溶劑對照給予稀釋倍數與最大藥物濃度相同的DMSO（下同）。除去含藥/溶劑培養基，并用新鮮培養基洗滌細胞2次，加入新的培養基，每孔加入10 μL CCK-8溶液。將培養板在培養箱內孵育4 h后用酶標儀測定450 nm處的吸光度（OD值）。

1.5 TUNEL法檢測細胞凋亡率

取對數生長期細胞，以2 mL/孔（3×105 cells）接種在6孔板中，37 ℃、5%CO2培養箱中預培養，待細胞生長至80%時，serum-starved 10 h。實驗組給予藁本內酯30、60、120 μmol/L，繼續培養12、24、48 h。1500 r/min離心5 min，收集細胞，用4%多聚甲醛固定細胞，置水平搖床上緩慢搖動30～60 min，重懸細胞，然后根據TUNEL試劑盒說明書采用流式細胞儀進行檢測。

1.6 Hoechst 33258熒光染色法檢測細胞核形態

細胞接種同“1.3”項。6孔板中置大小合適滅菌的載玻片。serum-starved 10 h后，實驗組分別給予30、60、120 μmol/L藁本內酯，繼續培養48 h。棄去培養液，用4%多聚甲醛在4 ℃條件下固定15 min，棄固定液養液，Hoechst 33258染色液室溫條件下染色15 min。鏡檢。

1.7 ELISA檢測血管內皮生長因子含量

細胞接種同“1.3”項。取對數生長期細胞，以2 mL/孔（3×105 cells）接種在6孔板中，37 ℃、5%CO2培養箱中預培養，待細胞生長至80%時，serum- starved 10 h。實驗組給予含藁本內酯30、60、120 μmol/L的無血清培養基，繼續培養48 h。取培養液，1000 r/min離心5 min，除去細胞碎片及顆粒物，收集上清。根據VEGF試劑盒說明書進行操作。

1.8 Western blot檢測核因子-κB、磷酸化JNK、Bcl-2及Bax蛋白表達

按“1.3”項步驟收集細胞培養液，冰浴的PBS洗1遍，用細胞刮子刮下細胞，1000 r/min離心5 min，收集細胞沉淀，分別提取總蛋白和細胞核蛋白。在細胞沉淀中加入適量裂解液（含蛋白酶或磷酸酶抑制劑），冰浴裂解30 min，每隔10 min高速渦旋15 s。4 ℃、12 000 r/min離心15 min，取上清，BCA法測定樣品中總蛋白濃度；用細胞核蛋白抽提試劑盒，根據說明書提取細胞核蛋白。上樣量為40 μg。一抗（兔抗人NF-κB（p65）、P-JNK、Bcl-2、Bax均按1∶1000稀釋）4 ℃過夜，二抗（1∶10 000稀釋）37 ℃孵育2 h， ECL法顯色。采用軟件Image pro plus 6.0分析條帶的積分光密度。

1.9 統計學方法

采用SPSS16.0統計軟件進行分析。實驗數據以—x±s表示，結果中“2.1”“2.2”項采用雙因素分析，其余數據進行單因素分析及LSD-t組間檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 藁本內酯對A549細胞活力的影響

與溶劑對照組比較，予藁本內酯孵育12、24、48 h后，細胞活力均明顯下降（P<0.05，P<0.01，P<0.001），說明藁本內酯能夠抑制A549細胞的增殖，其IC50分別為121.98、89.99、62.70 μmol/L。藁本內酯對A549細胞的抑制作用呈時間和濃度依賴性（P<0.05，P<0.01），兩者之間無交互作用（P>0.05）。結果見表1。

2.2 藁本內酯對A549細胞凋亡率的影響

根據不同作用時間藁本內酯的IC50值，將濃度為30、60、120 μmol/L的藥物作用于A549細胞12、24、48 h，檢測細胞凋亡率。與溶劑對照組比較，藁本內酯能增加細胞凋亡率（P<0.05，P<0.01，P<0.001）。結果見表2。

表1 各組不同時點A549細胞活力比較（—x±s，OD值）

組別 濃度（μmol/L） n 12 h 24 h 48 h

溶劑對照組 4 1.29±0.09 2.16±0.09 2.45±0.10

藁本內酯組 15 4 1.11±0.07 1.88±0.08* 1.99±0.08*

30 4 0.96±0.08** 1.59±0.04** 1.68±0.04**

60 4 0.81±0.06*** 1.28±0.05** 1.26±0.05**

120 4 0.60±0.04*** 0.96±0.04*** 0.93±0.06***

180 4 0.54±0.01*** 0.71±0.03*** 0.54±0.07***

注：與溶劑對照組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001（下同）

表2 各組不同時點A549細胞凋亡率比較（—x±s，%）

組別 濃度（μmol/L） n 12 h 24 h 48 h

溶劑對照組 4 5.69±0.98 8.42±1.03 12.36±1.04

藁本內酯組 30 4 10.40±1.02* 25.60±1.47** 35.47±2.38**

60 4 22.45±1.60* 35.79±2.43** 47.69±2.33****

120 4 45.64±2.08*** 51.16±2.81** 60.36±3.08****

2.3 藁本內酯對A549細胞核形態的影響

溶劑對照組細胞核邊緣完整，呈均勻弱藍色熒光；藥物作用48 h后，細胞核內可見濃染的顆粒塊狀強藍色熒光。早期凋亡的細胞核呈波紋狀或折縫樣，部分染色質出現濃縮狀態，晚期細胞核裂解為碎塊，染色質分割產生凋亡小體。結果見圖1。

注：A.溶劑對照組；B.藁本內酯30 μmol/L組；

C.藁本內酯60 μmol/L組；D.藁本內酯120 μmol/L組（下同）

圖1 藁本內酯作用48 h各組A549細胞核形態

（Hoechst 33258染色，×200）

2.4 藁本內酯對A549細胞培養上清液中血管內皮生長因子含量的影響

與溶劑對照組比較，給予30、60、120 μmol/L藁本內酯作用48 h后，VEGF含量下降，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01）。結果見表3。

表3 藁本內酯作用48 h VEGF含量比較（—x±s，pg/mL）

組別 濃度（μmol/L） n VEGF

溶劑對照組 4 50.45±0.18

藁本內酯組 30 4 40.61±0.24*

60 4 37.71±0.40**

120 4 35.78±0.16**

2.5 藁本內酯對核因子-κB、磷酸化JNK、Bcl-2、Bax蛋白表達的影響

30、60、120 μmol/L藁本內酯作用48 h后，細胞核中NF-κB p65亞基蛋白表達顯著增加，差異有統計學意義（P<0.01，P<0.001），結果表明給予藥物后NF-κB被激活移位至細胞核，發揮促凋亡作用。同時細胞中P-JNK蛋白水平升高，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.01），抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低，差異有統計學意義（P<0.05，P<0.001），促凋亡蛋白Bax表達升高，差異有統計學意義（P<0.01，P<0.001），Bcl-2/Bax比值降低。結果見圖2。

圖2 各組A549細胞NF-κB（p65）、P-JNK、Bcl-2及Bax蛋白表達

3 討論

本研究發現，藁本內酯能抑制A549細胞活力，其作用48 h的IC50是89.99 μmol/L。在Hoechst染色研究中發現藁本內酯作用48 h能夠使A549細胞核濃密致染強藍色熒光，使細胞核皺縮、分解，形成凋亡小體，并隨著藥物濃度的增加凋亡率升高，120 μmol/L藁本內酯凋亡率可達（60.36±3.08）%。

本實驗進一步研究了藁本內酯誘導A549細胞凋亡的機制。腫瘤細胞的增殖、轉移依賴新生血管的形成，VEGF是目前已知最有效的促血管生長因子，對腫瘤新生血管形成及腫瘤生長、浸潤、遷移起重要作用。VEGF促進腫瘤新生血管形成與腫瘤發病機制有確定性的關系。因此，針對VEGF/VEGF受體這一途徑為靶點尋找抑制劑，阻斷VEGF信號傳導，能夠達到抑制腫瘤生長的目的。研究表明，一種VEGF受體抑制劑SU6668能夠增加胰腺癌腫瘤細胞的凋亡，降低腫瘤微血管的密度[6]，川芎的主要活性成分可以下調VEGF的表達[7]，當歸揮發油中的活性成分之一丁烯酯酸內醋具有抑制新生血管形成的作用[8]，提示通過抑制腫瘤血管的生成來抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞凋亡，起到抗腫瘤作用。本實驗結果顯示，藁本內酯可以降低A549細胞培養上清液中VEGF的含量，提示這可能是藁本內酯誘導A549細胞凋亡的機制之一。

細胞凋亡是細胞內的程序死亡，哺乳動物細胞凋亡途徑分為線粒體途徑（或內在途徑）、內質網應激介導的細胞凋亡及死亡受體途徑（或外在途徑）。在死亡受體途徑中，首先配體誘導細胞表面的死亡受體，如腫瘤壞死因子受體家族三聚體化，在細胞膜上形成凋亡誘導復合物激活下游的Caspase8分子，進而引起隨后的Caspases級聯反應，引發細胞凋亡。NF-κB是核因子蛋白家族重要的一員，在細胞靜息狀態下以無活性三聚體p50/p65/IκB結合的形式存在于細胞質中，外來因素如炎癥因子、生長因子或趨化因子刺激時p50/p65被釋放出來并發生核移位，進而調控凋亡相關基因轉錄及蛋白表達；或在細胞外信號刺激下激活NF-κB誘導激酶，活化NF-κB，使其進入細胞核，促進NF-κB依賴的基因轉錄，誘導細胞發生凋亡[9]。NF-κB參與細胞增殖、細胞凋亡等過程是由腫瘤壞死因子受體家族通過死亡受體途徑介導。在本研究中發現，30～120 μmol/L藁本內酯預作用48 h后，A549細胞核中NF-κB p65亞基蛋白表達顯著增加，推測藁本內酯能夠活化NF-κB，使其移位至細胞核內，發揮促凋亡作用。藁本內酯通過何種途徑激活NF-κB還有待進一步的深入研究。

腫瘤壞死因子受體相關蛋白2還可以直接或間接激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）通路，通過三級酶促級聯反應，即Ras/Raf/MEK/ERK途徑激活JNK信號轉導通路[10]，而后作用于線粒體，促使細胞色素C釋放，即通過線粒體凋亡途徑，最終導致細胞凋亡。凋亡調節基因Bcl-2家族中Bcl-2生理功能是通過阻止線粒體細胞色素C的釋放而發揮抗凋亡作用，而Bax基因是屬于Bcl-2家族促細胞凋亡基因。Bcl-2/Bax鑲嵌在線粒體膜上，調控線粒體功能。JNK可以通過直接磷酸化激活Bim/Bmf，再通過Bax/Bak來發揮作用[11]。本實驗結果表明，藁本內酯促使細胞中JNK蛋白磷酸化水平升高，抑凋亡蛋白Bcl-2表達降低，促凋亡蛋白Bax表達升高。提示藁本內酯誘導A549細胞凋亡的機制可能是通過JNK蛋白磷酸化后進入細胞核激活下游凋亡靶基因及蛋白轉錄表達，即轉錄依賴的方式；或是通過JNK活化后直接調控凋亡相關基因Bcl-2/Bax的表達，促進細胞凋亡。

綜上，藁本內酯通過抑制VEGF的表達抑制腫瘤新生血管的形成，通過調控死亡受體途徑中的NF-κB蛋白的表達及線粒體途徑中P-JNK蛋白水平，降低Bcl-2/Bax比值誘導腫瘤細胞凋亡，發揮抗腫瘤作用。藁本內酯作為一個潛在的抗腫瘤藥物，其作用機制有待進一步深入研究。

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（收稿日期：2014-12-02；編輯：華強）