肺炎支原體肺炎誘導(dǎo)痰中肺炎支原體核酸檢測(cè)研究

彭寬志

肺炎支原體肺炎（MPP）是臨床上較為常見(jiàn)的兒童呼吸道感染疾病，肺炎支原體（MP）是常見(jiàn)病原體[1]。MPP的臨床表現(xiàn)缺乏特異性，容易誤診[2]，為能夠早期確診MPP，避免貽誤病情，需要一種能夠快速、準(zhǔn)確診斷MPP的檢查方法。MP核酸檢查在MPP的早期診斷中得到一定應(yīng)用，但關(guān)于其檢查敏感性和特異性的報(bào)道較少。本研究選擇了98例肺炎支原體肺炎（MPP）患兒，對(duì)比了MP-IgM、MP-DNA檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的一致性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2010年1月-2013年12月本院住院診斷為肺炎支原體肺炎98例患兒作為研究對(duì)象，所有患兒均符合《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》（第7版）關(guān)于MPP的診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]，X線(xiàn)檢查提示為片狀陰影炎癥浸潤(rùn)。其中男57例，女41例；年齡1~12歲，平均（6.2±1.3）歲；病程2~31 d，平均（18.4±5.9）d。98例患兒均采集痰液樣本置于-70 ℃冰箱中保存待檢。

1.2 誘導(dǎo)痰采集 誘導(dǎo)之前，為有效清潔患兒空腔、咽喉、后鼻部污染物，需進(jìn)行充分漱口。以濃度為3%高滲鹽水超聲霧化吸入，若感覺(jué)有痰液隨時(shí)咳出到清潔平皿中，為避免出現(xiàn)支氣管痙攣問(wèn)題，霧化時(shí)間不應(yīng)超過(guò)30 min。選取痰液標(biāo)本時(shí)，取符合標(biāo)準(zhǔn)的痰液1 mL，加入等量的痰液蓄積保護(hù)液，旋渦震蕩3 min，使其均勻，并于4 ℃環(huán)境下2000 r/min離心10 min，取上清液，將采集到的痰液樣本置于-70 ℃冰箱中保存待檢。

1.3 檢測(cè)方法 肺炎支原體免疫球蛋白（MP-IgM）、肺炎支原體DNA（MP-DNA）的檢測(cè)均由廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心完成。MP-IgM采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，MP-DNA采用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用PEMS 3.0軟件對(duì)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及分析，組間一致性采用Kappa檢驗(yàn)，并以U檢驗(yàn)排除抽樣誤差影響。以Kappa系數(shù)大小劃分6個(gè)區(qū)段的方法以表達(dá)結(jié)果一致性的強(qiáng)弱：（1）極差，Kappa系數(shù)<0；（2）差，Kappa系數(shù) 0~0.20；（3）弱，Kappa系數(shù) 0.21~0.40；（4）中度，Kappa系數(shù) 0.41~0.60；（5）高度，Kappa系數(shù) 0.61~0.80；（6）極強(qiáng)，Kappa系數(shù)0.81~1.00。

2 結(jié)果

MP-IgM、MP-DNA檢測(cè)結(jié)果的一致性較好，兩種檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的一致性較好，見(jiàn)表1~3。

表1 MP-IgM、MP-DNA檢測(cè)結(jié)果的一致性 例

表2 MP-IgM與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的一致性 例

表3 MP-DNA與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果的一致性 例

3 討論

肺炎支原體（MP）是兒童呼吸道感染的常見(jiàn)病原體，MPP是兒童呼吸道感染的常見(jiàn)疾病。嬰幼兒是MPP發(fā)病的高危群體[4]，但是其具體發(fā)病機(jī)制仍不十分清楚。一般認(rèn)為，MP感染成為重癥肺炎的重要原因，MP會(huì)攻擊并破壞機(jī)體的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致免疫防御屏障不完整，在MP表面電子致密P1蛋白末端結(jié)構(gòu)的作用下，使其黏附于呼吸道黏膜上皮細(xì)胞上，進(jìn)而破壞支氣管、細(xì)支氣管的黏膜層，破壞上皮纖毛活動(dòng)，誘發(fā)陣發(fā)性咳嗽[5]。有試驗(yàn)在MPP患兒的血液、腦脊液、皮膚水泡、胸水中分離出了MP，但是目前尚沒(méi)有權(quán)威資料證實(shí)MP侵入和MPP發(fā)病之間存在直接因果關(guān)系[6]。叢玲等[7]認(rèn)為，細(xì)胞免疫與體液免疫在MPP的發(fā)病過(guò)程中擔(dān)任了非常重要的角色，其作用發(fā)揮方式包括激活B細(xì)胞和T細(xì)胞，激活NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞以及巨噬細(xì)胞的溶細(xì)胞活力，激活免疫活性細(xì)胞并使其產(chǎn)生細(xì)胞白介素（如IL-2、IL-4、IL-6等）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等，在炎性細(xì)胞因子的浸潤(rùn)作用下，肺泡壁會(huì)逐漸增厚，導(dǎo)致組織損傷。有研究結(jié)果顯示，處于急性感染期的MPP患兒會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞免疫功能抑制，表現(xiàn)為淋巴細(xì)胞對(duì)MP的反應(yīng)顯著降低，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等生物抗原的反應(yīng)性下降[8]。綜合上述分析可知，MPP患兒存在免疫系統(tǒng)平衡遭到破壞情況，T淋巴細(xì)胞遭到抑制，尤其是CD8+T細(xì)胞、B淋巴細(xì)胞被激活，導(dǎo)致體液免疫功能失調(diào)。盡管目前MPP的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但有一點(diǎn)有非常明確的，MPP是多種因素綜合作用的結(jié)果，單一病因無(wú)法解釋肺外所有癥狀，MP對(duì)呼吸組織的直接侵犯作用不足以誘發(fā)MPP，而宿主免疫反應(yīng)改變?cè)贛PP發(fā)病過(guò)程中顯得更加重要。因此，臨床上普遍以免疫指標(biāo)的變化情況作為MPP臨床診斷、輕重判定、治療和預(yù)后的重要依據(jù)。

免疫球蛋白M（IgM）分子質(zhì)量最大的免疫球蛋白，廣泛分布于體液中，占血清Ig的5%~10%，能夠有效抵御菌血癥的發(fā)生，在機(jī)體的早期免疫應(yīng)答中作用明顯[9]。IgM在胚胎發(fā)育晚期的胎兒即可以產(chǎn)生，是個(gè)體發(fā)育過(guò)程中最早合成和分泌的抗體；同時(shí)，IgM在初次體液免疫應(yīng)答中出現(xiàn)抗體的時(shí)機(jī)也最早，是機(jī)體抗感染的先鋒。如果血液檢測(cè)結(jié)果提示檢出IgM，則表明機(jī)體近期有感染，因此，IgM在臨床上通常用于感染疾病的早期診斷。IgM具有較強(qiáng)的溶血、溶菌功能，抗原結(jié)合能力和補(bǔ)體激活能力也較強(qiáng)。血液中的免疫復(fù)合物質(zhì)在其他器官當(dāng)中也可沉積并使其受損，重癥MPP患兒多會(huì)伴發(fā)一種或多種肺外并發(fā)癥，如腦炎、心肌炎、腎小球腎炎以及溶血性貧血等。臨床經(jīng)驗(yàn)顯示，抗體量和MPP的病情輕重存在高度相關(guān)性，也表明肺炎支原體肺炎患者存在著體液免疫功能紊亂情況。周岳年[10]研究認(rèn)為，MPP的病程越長(zhǎng)，MPIgM抗體的陽(yáng)性率越高，患兒的感染程度、免疫功能均會(huì)影響肺炎支原體抗體的檢出率；另外，由于嬰幼兒的免疫系統(tǒng)尚未完全發(fā)揮作用，出現(xiàn)MP感染時(shí)，患兒有可能會(huì)發(fā)生不出現(xiàn)抗體的情況，對(duì)MP-IgM抗體的陽(yáng)性率產(chǎn)生影響，最終影響檢查的準(zhǔn)確性[11]。MP-IgM檢查的優(yōu)點(diǎn)在于操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)費(fèi)用低，大約1 h內(nèi)便可以獲得檢測(cè)結(jié)果，有利于臨床的早期診斷；加之檢測(cè)時(shí)不需要特殊儀器，適于在基層醫(yī)院中廣泛推廣使用。在本研究中，MP-IgM抗體檢測(cè)結(jié)果與MP-DNA檢測(cè)、金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果均保持了較高的一致性，證實(shí)MP-IgM抗體檢測(cè)結(jié)果具有良好的準(zhǔn)確性。

核酸是生命的最基本物質(zhì)之一，根據(jù)化學(xué)組成不同，核酸可分為核糖核酸（RNA）和脫氧核糖核酸（DNA）。相對(duì)于血清免疫學(xué)檢測(cè)方法，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法檢測(cè)MP-DNA檢出率的準(zhǔn)確性要更高、特異性要更強(qiáng)、敏感性要更高。采用誘導(dǎo)痰檢測(cè)肺炎支原體DNA，樣本獲得簡(jiǎn)便，且檢測(cè)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、靈敏度高，抗體水平對(duì)檢測(cè)結(jié)果基本上沒(méi)有影響，只要標(biāo)本中含有殘存的DNA片段，便可以檢出[12]。這在很大程度上彌補(bǔ)了肺炎支原體IgM高峰時(shí)間出現(xiàn)較晚，患兒免疫系統(tǒng)發(fā)育尚不成熟，無(wú)法對(duì)MP做出正確免疫應(yīng)答等不足。雖然該方法的檢出準(zhǔn)確率高，檢出結(jié)果時(shí)間較短（低于3 h），但是由于該方法需要特殊的檢測(cè)儀器，在推廣方面具有一定難度[13]。由于優(yōu)秀的第三方檢測(cè)機(jī)構(gòu)也能夠提供良好的MP-DNA檢測(cè)服務(wù)，可以在一定程度上解決上述問(wèn)題。綜合來(lái)看，MP-IgM抗體檢測(cè)所需時(shí)間更短、費(fèi)用更低，但是漏診率更高，適合于病程較長(zhǎng)的患兒；MP-DNA檢測(cè)能夠了解MP在患兒體內(nèi)的感染與復(fù)制情況，對(duì)于早期診斷、疾病復(fù)發(fā)判定均有較大幫助。

在本研究中，MP-DNA檢測(cè)結(jié)果與金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果均保持了很好的一致性，表明MP-DNA檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性很好，能夠?yàn)镸PP的臨床診斷提供有益參考。另外，根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)，肺炎支原體IgM陽(yáng)性的患兒的平均病程約為1周，所以，對(duì)于臨床上高度懷疑MPP患兒，可以在患兒1周病程內(nèi)采集誘導(dǎo)痰樣本進(jìn)行肺炎支原體DNA檢測(cè)，而待患兒病程超過(guò)1周后再進(jìn)行肺炎支原體IgM檢測(cè)，以提高診斷的可靠性，也能夠提高病情和預(yù)后判斷的科學(xué)性。對(duì)于免疫系統(tǒng)尚未發(fā)育完善的年齡低于2周歲的患兒，可以采用同樣方法進(jìn)行肺炎支原體DNA檢測(cè)，并對(duì)肺炎支原體IgM進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察，將兩種檢測(cè)方法進(jìn)行有效結(jié)合，大幅度提高M(jìn)P的檢出率，利于MPP的早期診斷和早期治療。綜上所述，筆者認(rèn)為肺炎支原體核酸的檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確性較好，能夠?yàn)榉窝字гw肺炎的早期診斷提供一定參考，如兩種方法在臨床上相互結(jié)合使用能夠發(fā)揮最佳效果。

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