小兒肺炎的細菌學耐藥性分析與檢驗質量控制

趙延香

小兒肺炎是兒科常見病與多發病，嚴重影響患兒的健康[1]。隨著抗生素的廣泛應用，小兒肺炎治療過程中的耐藥性問題日益突出，給臨床治療帶來了困難。解決這一問題的重要方法是進行細菌培養與藥敏試驗，選擇有針對性的抗生素進行治療。在小兒肺炎的診療過程中，臨床檢驗尤其是細菌培養尤為重要，在細菌培養過程中的質量控制顯得尤為關鍵[2]。臨床微生物室間質量控制主要涉及到質控管理機構和參控實驗室兩個方面，但歸根到底是提高參控實驗室的理論水平和技術水平，從而提高微生物檢驗質量，更好地為患者服務[3]。質量評定除了有外部機構對常規實驗室的工作質量進行評價這個功能外，還可以被看成是在實驗室外部設立的一個公眾質量控制標準，這個標準可以由一個或幾個參考實驗室確定，也可以由眾多的常規實驗室確定，參照這個標準，常規實驗室可以進行自我評價[4]。室間質量評定的另一個作用就是減小或消除實驗室間的誤差，使質量標準的可靠性更強，了解到的情況更全面[5]。本研究通過回顧性分析我院近3年以來診治的肺炎患兒的細菌學檢查結果與耐藥性分析，并且將檢驗的質量控制應用與整個檢測過程中，獲得了滿意的結果，現將研究報告總結一下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究臨床資料來源于2011年1月-2014年12月濟鋼總醫院診治的小兒肺炎患兒共140例，其中有男童79例，女童61例，年齡3個月~14歲，平均（6.39±1.38）歲。所有患者都滿足典型的小兒肺炎的臨床表現、實驗室檢查與影像學特征，入院后對所有患兒均進行痰培養加藥敏檢驗。

1.2 方法 采用吸痰管吸痰的方法，進行細菌培養與藥敏試驗。采用紙片擴散法敏感試驗，紙片擴散法是利用瓊脂的特性來測定細菌對抗菌藥物的敏感性，操作方法簡便，易于推廣，適用于不同醫院臨床細菌室應用，但因受紙片含藥量不均及接種菌液量等多種因素影響，其結果易出現偏差[6]。因此，國內外對藥敏試驗的標準化問題進行了多方面的研究和探討，以Kirby-Bauer紙片散法（簡稱K-B法）和對比法為主的藥敏檢測方法，把含有一定量抗菌藥物的紙片平貼在培養基之上，在紙片中的藥物可自然溶于培養基內。并向四周呈圓形擴散，藥物在瓊脂中的濃度距紙片越遠，藥物濃度也隨之下降，用時瓊脂表面接種的細菌也開始生長，當細菌被瓊脂內的藥物所抑制時，也是該藥對該細菌的最低抑菌濃度，此時該細菌生長受到抑制，在含藥紙片周圍形成透明的抑菌環。敏感試驗用培養基一般細菌用敏感試驗用培養基或M-H瓊脂培養基即可，因上述兩種培養基絕大多數細菌均生長良好，對磺胺、甲氧芐胺嘧啶，四環素的抑制物含量低，瓊脂表面pH值變化小，按程序配方制備培養基，傾注平皿約4 mm厚，選擇9 cm大小的培養皿。干燥含藥紙片標準紙片的直徑規定為6.35 mm，標準空白濾紙一張，（30±4）mg/cm2；紙吸水性為本身重量的2.5~3.0倍，紙本身為中性，限紙中的緩沖物質存在及二價金屬離子。標準比濁管的制備選管徑與制備菌液的相同的試管一支，管內加生理鹽水或蒸餾水5.2 mL，取肥達氏反應抗原一支（40億/mL）吸菌液0.2 mL，加入盛有生理鹽水的試管中，試管用膠塞塞緊，高壓消毒，取出后塞與管徑口處用石蠟封嚴，既成1.5億/mL左右的標準比濁管，此比濁管可用兩年[7]。

2 結果

2.1 患兒的細菌學構成統計 在140例肺炎患兒中，總共檢測出了78株的致病菌，陽性率是55.7%，大部分是革蘭陰性菌，54株（69.2%），包括肺炎克雷伯菌15株（19.2%），大腸埃希菌12株（15.4%），嗜血桿菌10株（12.8%），銅綠假單胞菌8株（10.3%），陰溝腸桿菌5株（6.4%），鮑氏不動桿菌3株（3.8%），產氣腸桿菌1株（1.3%）。革蘭陽性菌22株（28.2%），包括肺炎鏈球菌12株（15.4%），金黃色葡萄球菌6株（6.4%），表皮葡萄球菌4株（3.8%）。其他2株（2.6%）。

2.2 患兒的病原菌耐藥性統計 革蘭陰性菌大部分是對氨芐西林耐藥，主要的4種病原菌的耐藥率在80%以上，然后是對頭孢菌素類耐藥，在50%以上，而對亞胺培南與美洛培南敏感。革蘭陽性菌對青霉素及紅霉素耐藥，耐藥率在70%以上，對萬古霉素敏感，見表1~2。

2.3 質量控制效果 在細菌培養與藥敏試驗過程中，采用質量控制，未出現嚴重不良事件，有效保障了臨床檢驗的質量。

3 討論

在小兒就診的疾病中，小兒肺炎的發病率較高，是小兒常見病與多發病，如不及時救治，死亡率較高[8]。小兒肺炎的病因較多，一般為微生物感染，微生物包括細菌、病毒、支原體、衣原體等[9]。隨著抗生素的廣泛應用，雖然小兒肺炎的臨床治療效果得到了很大提高，但同時也產生了很多問題，其中耐藥病原體的產生是難以回避的嚴重問題[10]。耐藥性的產生除了與細菌變異有關之外，抗生素的濫用同樣是重要原因，為了避免抗生素濫用，必須對患者進行痰細菌培養與藥敏實驗，選擇有針對性的抗生素，進行“靶向治療”，既能夠起到良好的治療效果，同時又能盡可能的減少耐藥細菌的產生[11]。在本次臨床研究中筆者發現了有24株的銅綠假單胞菌感染，此細菌是院內感染的主要病原體，給臨床治療帶來了極大的困難[12]。

表1 革蘭陰性菌的藥敏實驗結果

表2 革蘭陽性菌藥敏實驗結果

所謂細菌培養是指自感染部位培養出致病菌是感染的直接證據，而且作細菌的藥物敏感性試驗可指導臨床合理用藥。因此，細菌培養對細菌感染性疾病的診斷和治療是非常必要的[13]。細菌培養時標本的留取是第一步，也是關鍵的一步，如果標本被污染，細菌的分離、鑒定則無法進行，因此在留取標本時應注意以下幾點：（1）留取標本一定要使用無菌容器；（2）正常無菌部位的標本（如血液、腦脊液、胸水、腹水等）在留取時嚴格執行無菌操作技術；（3）有正常菌群生長的部位（如痰、糞便、眼結膜等部位）在取標本時注意不要再被其他部位的細菌污染。留取尿液時要先清洗外陰，留取痰液時要先用生理鹽水漱口。

細菌對抗藥物的敏感試驗，可進行流行病學調查及對醫院內感染調查提供依據，同時為臨床醫師的治療提供參考，為用藥提供依據。而指導臨床醫生和流行病醫生在某一時期應使用何種抗菌藥物，并可減少院內感染的發生。為了確保臨床細菌檢驗技術更好地發揮其在臨床診斷和治療中的重要作用，必須認真搞好質量控制工作[14]。然而，臨床細菌檢驗工作本身是一門定性科學，其研究的主要對象是從各種臨床標本中所分離培養出來的活的細菌。

每個實驗室都必須有一本指導日常工作、簡明扼要的操作規程。由衛生部醫政司頒布的《全國臨床檢驗操作規程》是一本較適合各級醫院細菌實驗室的技術資料，實驗室可根據自己的實際情況對該操作規程做適當修訂，進一步達到更高的技術水準。修改操作規程的工作須由技術主管人員完成。實驗室應該保存參考菌株，有兩種簡便的保存方法。一種是高層瓊脂保存法，取長試管，最好是螺口試管，用營養瓊脂或MH瓊脂制成高層瓊脂，將細菌穿刺接種在培養基中，擰緊管帽或用膠塞塞緊，使不透氣，置避光處室溫或4 ℃冰箱保存[15]。用時開啟，移種到相應的培養基，得到新鮮菌種，這種保存細菌方法，較長時間內不會死亡。另一種是低溫保存法。將細菌在固體培養基上增菌，用小牛血清或全羊血將菌落洗下，置三角瓶或其他容器中，再放入無菌玻璃珠，置-30 ℃以下低溫冰箱內保存，需要時用無菌鑷子取出一粒玻璃珠置增菌培養基中，可獲得新鮮菌種。這種方法能長期保存細菌。

藥敏試驗有紙片擴散法和稀釋法兩種，質量控制標準不一樣。紙片擴散法為藥敏試驗直接測定抑菌環直徑。因為其屬于定量測定，以數理統計的方法確定其質量控制標準。參考菌株的抑菌環質量控制標準是，藥物對該菌株的抑菌環直徑平均值±2標準差。為了簡明起見，將這個指標換算成抑菌環直徑質量控制允許范圍。實驗室進行室內質量監測，連續30次監測的結果只允許最多3次超過質量控制范圍，并且這3次失控不應該連續出現。

現行的質量控制方法是在試驗達到穩定的狀態后，每周做1~2次監測，并繪制質控圖，在連續的監測中，每30次中只允許有3次超過質量控制的允許范圍，而且這3次不得連續出現。如果連續2次出現超過允許范圍，必須改為每日監測，并尋找失控的原因，進行必要的糾正。質量監測的情況應完整地記錄下來，以便進行分析。對于計數數據，用點圖的方法記錄比較直觀，如溫度、濃度、藥敏試驗的抑菌環直徑或MIc值。這種記錄方法也稱質量控制圖。藥敏試驗的質控圖最好將每個參考菌株監測各種藥物的結果記錄在同一張圖上，這樣，可以方便地比較各個藥物抑菌環的變化情況，利于辨別真失控或假失控[16]。

國內于20世紀80年代初開展了細菌檢驗的質量評價工作。就目前國內的現狀而言，應認為有兩種層次的質量評價活動，分別為初級活動和正常活動。初級活動有兩個特點：模擬標本為純菌種，活動頻率較低。正常的質量評價活動應針對現代醫院細菌感染的實際情況進行，質量評價工作的重點應該是考察實驗室是否漏檢。目前，由衛生部臨床檢驗中心組織的全國性質量評價活動已經朝此方向發展，使用混合菌模擬標本做質量評價。正常的質量評價活動的另一特點是增加活動的頻率。高頻率的活動迫使實驗室不得不以常規的技術力量和按日常工作條件對待質量評價的標本，真實地反映出實驗室的日常工作水平，并且可以通過質量評價活動開展技術培訓。為了擴大工作人員的眼界，可提供少見的細菌或新發現的病原菌，并備有必要的說明。

本次研究結果顯示，對于小兒肺炎的臨床診療，及時對患兒進行痰培養及藥敏實驗是十分必要的，臨床應盡早采用敏感性抗生素，提高臨床治療效果。對于檢驗科人員，在細菌培養與藥敏試驗過程中，采用質量控制，未出現嚴重不良事件，有效保障了臨床檢驗的質量。

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