乙型肝炎標志物檢測誤差分析

摘要：目的 通過ELISA法檢測乙型肝炎標志物過程中常見誤差的分析，了解這些因素會造成的結果，及其處理方法，為臨床診斷提供真實可靠的依據。方法 酶聯免疫酶標法（ELISA法），嚴格按照試劑盒說明書檢測。結果 造成檢驗結果出現假陽性或假陰性的因素是多樣的，其中最主要的影響因素是實驗室操作，試劑，檢驗方法。結論 乙肝標志物酶法檢測時要排除各種影響因素的干擾，盡量杜絕出現誤差結果，確保檢測結果的準確性。

關鍵詞：乙型肝炎標志物檢測；誤差

乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒（HBV）引起的一種世界性疾病[1，2]。我國是乙型肝炎病毒感染的高流行區。酶聯免疫酶標法（ELISA法）是20世紀70年代發展起來的一種檢測技術，盡管當前乙型肝炎標志物的檢測新技術如化學發光法、聚合酶鏈反應、時間分辨免疫熒光法及電化學發光法等被不斷建立、應用，ELISA因其實用、簡便、經濟、環保且敏感度較高，被用為檢測乙肝血清標志物的首選方法。但是其影響因素較多，在臨床工作中，常常出現誤差。

1 標本因素

1.1標本需認真核對患者信息，采集標本最好是真空速凝采血管。如果使用塑料管，因為塑料管能吸附抗原物質，標本放置過久會使抗原含量降低，造成假陰性。

1.2采集標本后分離血清的時間要控制好，如果在血液尚未開始凝固時便強行離心分離血清，使血清中仍殘留部分纖維蛋白，在ELISA法檢測過程中易造成假陽性的結果。分離血清后要及時檢測，避免溶血。在冰箱中保存過久的標本，不敢保證保存過程中是否受到細菌污染，而產生非特異顯色，導致本底深而出現假陽性。

1.3出現嚴重溶血的標本時，反應孔對血紅蛋白有非特異性吸附作用，細胞內液進入造成對血清的稀釋作用，所以輕度溶血也會造成假陽性結果。

2 試劑的影響

試劑質量是影響檢測結果的直接因素，不同廠家的試劑，其靈敏度和特異性也存在一定的差異，其抗原抗體純度、抗體的滴度、親和力和特異性對測定結果產生直接影響，另外試劑應該用冰箱保存，使用前必須放置至室溫且最好1w內用完。

3 操作因素

3.1首先要使用一次性加樣吸頭，避免污染并定期校正加樣器，先將試劑盒從冰箱取出，置室溫平衡20min后使用，試劑用完及時放回冰箱冷藏。另外加樣過程中一定要垂直加入準確量的血清。避免出現加錯孔或把血清或酶噴濺到反應孔外，造成污染。注意勿觸及包被板底部，以免擦傷包被物，使抗體（抗原）脫落而影響實驗結果的準確性。

3.2抗原抗體結合及酶促反應對溫度的要求很嚴格，一般ELISA檢測乙肝五項的放置的溫度為37℃。溫度高于45℃易引起失活及標記物脫落，溫度低于4 ℃，則影響反應速度。干浴與水浴有明顯差異，盡可能使用水浴，井將固相板放入水中，使其受熱均勻要貼上密封膜，防止污物侵入。

3.3 ELISA法的另一個重要環節就是洗板。首先是加樣后放置一定時間后洗板，洗滌液的濃度一定要嚴格按說明書配制，濃度過小就有可能使陰性標本出現假陽性實驗操作時，最佳洗板次數為7次，否則有可能出現大量假陽性結果。洗板液泡板時間過短，也會造成大量假陽性結果。因此，洗板時不能急于將洗滌液從板孔中倒掉，而要將洗滌液在孔中停留一段時間，這樣就能洗得更干凈，提高結果的準確性。手工洗板一次把反應孔內的纖維蛋白凝塊洗掉以免堵塞洗板機。洗板時要注意每孔注滿，且不能讓洗液溢出反應孔，否則造成相互污染，板上的殘液沒有拍干凈，也會影響檢測的陰性標本，使其出現假陽性。此外洗板機要定期清洗，以免長細菌降低洗板質量。

4 結果判定

ELISA法最早是根據肉眼觀察顯色的深淺判定結果，存在一定的客觀性，所以現在在部分醫院現在都運用酶標分析儀檢測，才能確保結果的一致性。酶標儀也要定期進行檢測①陰性、陽性及空白對照OD值分析：注意試驗設定的陰、陽對照及空白孔的吸光度是否在設定的有效范圍內，因為由此計算出來的Cutoff值將直接影響到樣本陰、陽性的判讀；②質控品的分析：調出乙肝質控圖分析測得的數據是否在控。若為失控應積極配合質量控制小組分析失控原因，評估本次試驗的可信度以及是否可以發報告；③酶標儀判讀要與肉眼判讀進行比對，儀器亦存在偶然的誤差，儀器判讀還是要與肉眼觀察相配合，才能得出正確的檢測結果。

5 其它干擾因素

5.1鉤狀效應指的是隨著被測物濃度的增高顯色反而減弱甚至不顯色，這是由于固相抗體只結合一定量的抗原，在抗原濃度過高時，抗體被過量抗原飽和，不能結合固相抗體，而導致假陰性。

5.2干擾物質的影響 根據統計，約有40%的人血清中含有特異性干擾物質。常見的干擾物質有：類風濕因子、補體、嗜異性抗體、嗜靶抗原自身抗體、醫源性誘導的抗鼠Ig.抗體、交叉反應物質和其他物質等.可采用56℃ 30min滅活補體來降低假陽性的檢出率。

5.3一些藥物會影響乙肝ELISA法檢測，如高效價的免疫球蛋白與乙肝表面抗原形成復合物，影響乙肝表面抗原的檢出。用0.5M的鹽酸處理標本1h，可提高陽性檢出率。另外，為了預防乙肝，部分乙肝表面抗原陰性的人群在接種乙肝疫苗后的1～2w內，血清中可以檢出乙肝表面抗原的成分，形成一過性的乙肝表面抗原陽性。所以，建議人們在接種過乙肝疫苗后1個月內不再做乙肝表面抗原的檢測。

綜上所述，盡管ELISA法操作簡單，但可能影響測定結果的因素也較多。故在實際操作的過程中，除了選擇優良試劑外，必須規范、仔細的操作，同時作好室內質控、室間質評，以嚴謹的工作作風檢測每一份標木，才能保證檢測質量。盡量避免或減少人為干擾因素對結果的影響，，協助臨床，報出更準確的檢驗結果。

參考文獻：

[1]王璐.ELISA法檢驗乙肝標志物影響因素的探討[J].醫學理論與實踐，2012（4）.

[2]彭俊云.酶聯免疫吸附試驗（ELISE）常見問題的原因分析與處理辦法[J].中國醫藥導報2008，5（15）：118-120.

編輯/哈濤