負(fù)載RPL8蛋白DC的制備及鑒定

摘要：目的 制備RPL8蛋白沖擊的樹突狀細(xì)胞。方法 構(gòu)建重組原核表達(dá)載體pET28a（+）-RPL8，IPTG誘導(dǎo)RPL8融合蛋白表達(dá)，RPL8蛋白純化后用SDS-PAGE及Western blot進(jìn)行鑒定；分離小鼠骨髓細(xì)胞，經(jīng) rmGM-CSF、rmIL-4體外誘導(dǎo)培養(yǎng)DC，流式細(xì)胞儀檢測(cè)DC表面標(biāo)志；RPL8蛋白致敏DC后，采用熒光標(biāo)記抗體熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞RPL8負(fù)載情況。結(jié)果 經(jīng)雙酶切及PCR鑒定可見大小約774bp的條帶，純化蛋白經(jīng)Western blot分析見28kD大小的特異性條帶；體外培養(yǎng)的DC具有典型的樹突狀結(jié)構(gòu)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞高表達(dá)CD11C、CD80、MHC-Ⅰ類、MHC-Ⅱ類分子，RPL8蛋白致敏DC后，DC見綠色熒光。結(jié)論 成功制備RPL8蛋白沖擊的DC疫苗，為進(jìn)一步黑色素瘤免疫治療研究提供基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞： RPL8；樹突狀細(xì)胞；黑色素瘤

樹突狀細(xì)胞（dendritic cell，DC）是功能最強(qiáng)大的專職抗原提呈細(xì)胞，具有很強(qiáng)的激活CD8細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL）及CD4輔助T細(xì)胞的能力，能夠敏感的識(shí)別入侵的病原微生物和腫瘤細(xì)胞，通過快速地釋放大量細(xì)胞因子參與固有免疫應(yīng)答，因此DC是先天免疫和適應(yīng)性免疫的橋梁，是免疫系統(tǒng)的哨兵[1]。本實(shí)驗(yàn)以RPL8蛋白為抗原，沖擊致敏樹突狀細(xì)胞，為進(jìn)一步對(duì)黑色素瘤的免疫治療效果奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 動(dòng)物：6～8周齡，體重22～25g，雌性C57BL/6小鼠購(gòu)于重慶第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。主要試劑： E.coliDH5a、BL21、pET28a （+）質(zhì)粒、pUC57-RPL8質(zhì)粒由本實(shí)驗(yàn)保存；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶HindⅢ和EcolⅠ購(gòu)自Takara公司；質(zhì)粒中小量提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；RPMIl640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國(guó)Hyclone），重組鼠-集落刺激因子（rmGM-CSF）、重組鼠白介素-4（rmlL一4）（peprotech公司）；LPS（Sigma公司）；抗鼠CD80-PE、CD11C-PE、MHCI-APC、MHC1I-FITC流式細(xì)胞熒光標(biāo)記抗體及相應(yīng)的同型陰性對(duì)照（eBioscience公司）；Anti-HisTag一抗、羊抗鼠IgG，F(xiàn)ITC（MILLIPORE公司）。

1.2 方法

1.2.1 pET28a（+）-RPL8原核表達(dá)載體的構(gòu)建及鑒定 以我室保存的pUC57-RPL8為模板，PCR擴(kuò)增目的基因RPL8，上游引物：CGGAATTCATGGGCCGTGTGATCCCA，下游：CCAAGCTTCTAGTTCTCCTTCTCCTGTACAGTT。EcoRⅠ/HindⅢ雙酶切pET28a（+）及pUC57-RPL8，酶切產(chǎn)物經(jīng)純化試劑盒純化，DNAT4連接酶連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入DH5α菌，接種于含Kana（50μg/ml）的LB平板，培養(yǎng)過夜后挑取單菌落接種于含Kana的LB培養(yǎng)液中震蕩培養(yǎng)，結(jié)束后參照Omega質(zhì)粒提取試劑盒說明書提取質(zhì)粒，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切、PCR鑒定后，取樣送上海生物工程公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 目的蛋白的表達(dá)及純化 取培養(yǎng)好的菌液，離心棄上清，沉淀備用。按His-Tag純化試劑盒說明純化蛋白。取適量的純化所得的融合蛋白，加入等體積的5×SDS上樣緩沖液，煮沸后進(jìn)行Western-Blot鑒定。

1.2.3 DC細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及鑒定 將C57BL/6小鼠脫頸處死，無菌剝離脛骨、股骨及肱骨，剪去兩端的骨骺。用PBS反復(fù)沖洗髓腔兩端，離心棄上清。破紅細(xì)胞，PBS中和反應(yīng)，離心棄上清，重懸于含10ng/ml的GM-CSF、rmIL-45ng/ml及含10%胎牛血清的RPMI640培養(yǎng)液中，接種于6孔板內(nèi)培養(yǎng)。第6d加入LPS（200ng/ml），繼續(xù)培養(yǎng)2d，倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞表面CD11c、CD80、MHC-I類及MHC-II類分子的表達(dá)。

1.2.4 RPL8蛋白沖擊DC的制備及鑒定 DC和RPL8蛋白（終濃度為10ug/ml）混合培養(yǎng)24h后加入Anti-His Tag一抗，37℃、5%的CO2孵育1h 后，離心，PBS洗滌，加帶FITC羊抗鼠IgG，室溫避光1h后，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增pUC57-RPL8及重組質(zhì)粒酶切電泳鑒定結(jié)果 重組載體的PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳，可見約774bp的條帶.重組質(zhì)粒片段大小約為6124bp，重組質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后得到大小兩個(gè)片段，大的片段為5350bp，小的片段大小約為774bp。重組質(zhì)粒送公司測(cè)序后圖譜顯示堿基序列與Gene Bank所示RPL8的mRNA序列完全一致。

2.2 純化蛋白的鑒定 重組蛋白經(jīng)Western Blotting驗(yàn)證，見約28kDa大小的條帶（見圖1）。

2.3 倒置顯微鏡下觀察DC的形態(tài) 從小鼠骨髓獲得的DC前體細(xì)胞培養(yǎng)2d后開始出現(xiàn)小的細(xì)胞集落，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，集落增大；培養(yǎng)至第6d細(xì)胞懸浮，第8d經(jīng)LPS誘導(dǎo)后24h后出現(xiàn)不規(guī)則的突起和毛刺狀，即為典型的樹突狀形態(tài)

2.4 DC表面標(biāo)志用流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析 未經(jīng)LPS誘導(dǎo)的DC，特異性標(biāo)志CD11c表達(dá)低，共刺激分子CD80、MHC-I、MHC-II類分子低表達(dá)；經(jīng)LPS誘導(dǎo)48h后的DC表面標(biāo)志符合成熟DC的特點(diǎn)， CD11c、CD80、MHC-I、MHC-II類分子等高表達(dá)

2.5 RPL8蛋白沖擊DC疫苗的鑒定 DC和RPL8蛋白混合培養(yǎng)24h后加入Anti-His Tag一抗，37℃、5%的CO2孵育1h，1200r/m離心5min，PBS洗滌；加帶FITC羊抗鼠IgG，室溫避光1h后，熒光顯微鏡下觀察的熒光細(xì)胞即為負(fù)載RPL8的DC

3討論

核糖體蛋白L8[2]是研究發(fā)現(xiàn)在腦膠質(zhì)瘤、乳腺癌和黑色素瘤中有高度表達(dá)，能被CD4+HLA-DR7限制性的Th細(xì)胞識(shí)別，提示RPL8可作為腫瘤抗原用于RPL8陽性腫瘤患者的治療，成為免疫治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。RPL8作為腫瘤抗原，沖擊DC后具有能與HLA類分子結(jié)合的表位，免疫小鼠后可刺激CD4+T和CD8+T細(xì)胞，使CTL反應(yīng)能力增強(qiáng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性抗腫瘤細(xì)胞免疫抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。

為獲得該抗原，本實(shí)驗(yàn)選擇原核細(xì)胞表達(dá)技術(shù)，優(yōu)點(diǎn)是能在較短時(shí)間內(nèi)獲得基因表達(dá)產(chǎn)物，制作成本低且容易培養(yǎng)。所選擇的表達(dá)載體是PET載體系統(tǒng)成員pET28a（+），是目前E.coil中克隆表達(dá)重組蛋白功能最強(qiáng)大的系統(tǒng)，目的基因被克隆至PET質(zhì)粒載體上，受到噬菌體T7強(qiáng)轉(zhuǎn)錄和翻譯信號(hào)的控制，表達(dá)由宿主細(xì)胞提供的T7RNA聚合酶誘導(dǎo)，T7RNA聚合酶機(jī)制十分有效且具有選擇性，充分誘導(dǎo)時(shí)，幾乎所有細(xì)胞都可表達(dá)目的蛋白。通過PCR擴(kuò)增RPL8目的基因，瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)在約774bp處有清晰條帶；經(jīng)EcoRI、HindIII雙酶切后，連接至原核表達(dá)載pET28a（+），構(gòu)建pET28a（+）-RPL8原核表達(dá)重組質(zhì)粒，經(jīng)測(cè)序分析后與Gene Bank中所示的mRNA序列一致，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，大部分以包涵體形式存在，而形成包涵體較有利于純化，經(jīng)SDS-PAGE電泳和Western Blotting鑒定，在28KDa處有明顯條帶，與Chan YL等[3]描述的一致，表明成功獲得RPL8蛋白。在細(xì)胞因子rmGM-CSF、rmlL-4和LPS的誘導(dǎo)下體外大量擴(kuò)增DC，該方法簡(jiǎn)單、可靠，可以獲取大量純度高且成熟的DC。以DC作為腫瘤疫苗的載體，以RPL8腫瘤抗原體外沖擊致敏，這樣的疫苗不僅能保證抗原能被有效的攝取和提呈，還能提供可攻擊腫瘤細(xì)胞所必須的共刺激信號(hào)。RPL8蛋白與成熟的DC混合培養(yǎng)后加入抗HIS的一抗和帶FITC的羊抗鼠的IgG，熒光顯微鏡下觀察DC內(nèi)有綠色熒光，表明RPL8蛋白沖擊的DC疫苗制備成功。

參考文獻(xiàn)：

[1] Mahnke K， Sehmitt E，Bonifaz L， et a1. Immature， but not inactive the Tolerogenic function of immature dendritic cells[J].Immunol Cell Biol， 2002，80（5）：477-483.

[2] 談艷芳，杜清波，黃俊瓊.RPL8基因修飾鼠樹突狀細(xì)胞的制備探討[J].遵義醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011，34（5）：469-472.

[3] Chan YL， WoollG. The primary structure of rat ribosomal protein L8[J].Biochen Biophys Res Commun ， 1992， 185（2）：539-547.

編輯/王海靜