兩種檢測乙型肝炎病毒DNA定量方法的比較與評價

摘要：目的 評價兩種檢測乙型肝炎病毒（HBV）DNA方法的特點。方法 用美國DIGENE公司生產的Hybrid Capture-II HBV DNA試劑（HC-II）和深圳匹基生物工程股份有限公司生產的HBV DNA定量熒光PCR檢測試劑（PG），定量檢測HBsAg陽性的慢性乙肝患者血清中的HBV DNA。結果 HC-II試劑的HBV DNA 檢測陽性率達98.6%，PG試劑達到94.6%，兩者的符合率為93.2%。用系列稀釋的患者血清，測定兩種定量檢測方法的靈敏度，PG試劑略高于GC-II試劑。HC-II在HBV DNA濃度較高時的定量關系精度較好，而在HBV DNA低滴度時，兩者的定量誤差均加大。用兩種方法檢測HBV DNA 定量監測抗病毒藥物治療慢性乙型肝炎的療效，所測定的HBV DNA 滴度呈相同變化趨勢。結論 兩種HBV DNA 定量檢測方法均較高的靈敏度，在抗病毒藥物療效觀察方面有較高的應用價值。

關鍵詞：肝炎病毒；乙型；脫氧核糖核酸；定量檢測

乙型肝炎病毒（HBV）DNA 是反映HBV復制的最直接、最可靠的指標，在評價治療乙型肝炎藥物的療效與預后判定方面，HBV DNA 的檢測具有至關重要的作用。檢測HBV DNA 的方法有很多種。斑點雜交和聚合酶鏈反應方法（PCR）是常用方法，但兩者均不能進行定量檢測，因此其臨床應用價值有限。近幾年發展起來的定量核酸檢測方法可以對病毒核酸進行相對的定量檢測，對于藥物治療效果的評價和病毒復制活性的判定很有意義。目前為止，定量檢測HBV DNA 的方法很多，但還沒有統一的檢測標準，各種方法之間難以進行橫向比較。本研究采用美國DIGENG公司生產的HBV DNA 檢測試劑盒HC-II和深圳匹基生物工程股份有限公司生產的HBV DNA 熒光定量檢測試劑盒，對74份HBV表面抗原（HBsAg）陽性血清進行HBV DNA 的定量檢測，并對兩種方法的特點進行評價。

1 資料與方法

1.1一般資料 慢性乙型肝炎患者血清46份，均符合2000年西安會議修訂的病毒性肝炎診斷標準。

1.2取已知HBV DNA 強陽性的血清1份，以10小牛血清按10倍梯度系列稀釋，獲得系列稀釋血清為：10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。用兩種方法分別測定HBV DNA 滴度，以確定兩種方法的靈敏度。

1.3 HBsAg、乙型肝炎e抗原和抗乙型肝炎的檢測：用ORGANN TEKNIKA Reader2305酶標儀進行HBsAg、乙型肝炎e抗原（HBeAg）和抗乙型肝炎e抗原（抗- HBe）常規檢測（HBsAg試劑為荷蘭阿克蘇公司產品。HBeAg和抗HBe試劑為意大利澳斯邦公司產品）。

1.4 HC-方法 美國DIGENE公司生產的第二代基因雜交信號放大系統（ HC-II），先將預先制備的DNA-RNA雜交體特異性抗體包被在標準酶聯吸附試驗（ ELISA ）板上，再將血清中待測的靶DNA變性解鏈，加入與靶 DNA互補的RNA探針.復性后， RNA探針與靶DNA互補結合為 DNA-RNA雜交體。將DNA-RNA雜交體加入ELISA板上，則包被的特異性抗體捕獲雜交體。加入堿性磷酸酶標記的第二抗體，每個DNA-RNA雜交體均可結合多個酶標記的第二抗體，從而使信號得到放大。加入底物后，堿性磷酸酶可催化底物并發出淡黃色熒光，用靈敏的化學發光檢測器檢測熒光強度，根據熒光的有無和強弱判斷靶 DNA的有無和含量。

1.5實時動態熒光PCR檢測 所用儀器為Roche公司LigtCyclerTM，HVB DNA定量熒光PCR檢測試劑為深圳匹基生物工程股份有限公司（簡稱PG）產品。其檢測原理如下：在該PCR反應體系中，除一對引物外，還有一條能與PCR產物雜交的雙熒光標記探針，在該探針的兩端分別標記有熒光信號基團和熒光淬滅基團。熒光信號基團發出的熒光信號可被鄰近的熒光淬滅基團揚吸收而不能測出。如果該探針被切斷，則信號基團發出的熒光信號可被儀器接收。在PCR反應開始后，PCR引物和熒光標記探針均與待測的靶基因互補結合，在Taq酶的催化下，開始鏈延伸。因Taq酶兼具有外切本科酶活性，因此當新合成的DNA鏈延伸至熒光探針處時，則將熒光探針切斷，釋放出熒光信號基團，所發出熒光可被儀器接收。被釋放的熒光基團數量與PCR產物數量成一定比例關系，因此，測定熒光信號的強弱，可推算出PCR產物的拷貝數。

2 結果

2.1 HBV DNA 檢測結果比較 見表1。在74份標本中。兩種方法共同測定陽性69份，共同測定陰性0份，符合93.2。

2.2定量曲線 從原濃度血清到10-3稀釋度之間，HC-II方法表現出非常好的定量梯度曲線，定量精度很高，直線回歸方程的斜率等于1；從原濃度血清到10-4稀釋度時，其直線回歸方程的斜率也達到0.954。在10-4以上的稀釋度，定量梯度曲線變得逐漸平坦，斜率約0.71。PG試劑在HBV DNA高濃度時的線性關系不如HG-II試劑，斜率約0.6。但其測定值的數量范圍較寬，因此在DNA低濃度時仍能保持相當好的線性關系。

2.3 HBeAg/抗-HBe與HBV DNA定量檢測結果的關系：根據HBeAg/-HBe檢測結果，將患者分為三組，其對應的HBV DNA定量結果見表2。

2.4 HBV DNA的測定單位 兩種方法的測定單位均為\"拷貝/ml\"，但兩者的測定絕對值相差較多，HC-II的測定值比PG試劑約高1.65log10。由于目前沒有統一的測定標準，因此不能判定哪一種方法的測定值更準確。

3 討論

目前定量檢測HBV DNA的方法有多種。HC-II的主要特點是，檢測過程中不進行PCR擴增，南昌是使用分子雜交、抗體捕獲的方法，因此穩定性和重復性好。此外，HC-II在雜交時用的是HVB DNA全基因分子探針，因此結合牢固，即使有部分基因發生突變也不影響分子雜交，從而提高了陽性檢出率。深圳PG公司用的實時熒光PCR法，靈敏度很高，定量關系也較好。本研究檢測的74份血清，HC-IIP的陽性率為98.6%，PG試劑為94.6%，兩者的符合率為93.2%.HC-II試劑的檢出范圍為1.4×105～1.7×109拷貝/ml，PG試劑的檢出范圍為8.6×102～1.5×108拷貝/ml。同一份標本兩種不同的方法檢測，HC-II的測定值大于PG試劑約為1.65log10。需要說明的是，兩者的檢測單位名稱雖然相同，但沒有可比性和等量關系，從上述兩種檢測方法的檢測范圍，不能說明兩種方法何者實際檢測范圍寬或檢測靈敏度高。

以10倍梯度稀釋的乙型肝炎患者血清考查兩種檢測方法的靈敏度，HC-II方法可測到10-6水平，PG試劑可測到10-7水平，但兩者的測定值在10以后線性關系較差，曲線變得平坦。從稀釋曲線看，HC-II的線性關系尤其是從原濃度血清至10-4段，直線的擬合度極佳，優于PG試劑。在高稀釋度時，兩者的定量關系均不太理想，因此低濃度的HBV DNA在定量測定時可能誤差會增大。

我們觀察4例患者治療前后的系列血清，兩種HBV DNA定量方法測定的結果呈相同變化趨勢，兩條曲線吻合較好。表明兩種HBV DNA宣定量的方法均可很好地監測抗病毒治療的效果。此外，兩種方法檢測時間均較短，一般4h左右即可完成全部檢測。

參考文獻：

[1]Ho SK， Chan TC，Cheng IK， et al. Comparison of the second-generation Digene hybrid capture assay with the Brached-DNA assay for measurement of hepatitis B virus DNA in serum[J]. J Clin Microbiol ，1999，37：2461-2465.

[2]Chan HL， Leung NW， Lau TC， et al. Comparison of three different sensitive assays for hepatitis B virus DNA in monitoring of responses to antiviral therapy[J]. J Clin Microbiol， 2000， 38：3205-3208 編輯/哈濤