肽核酸探針在微生物診斷領域中的應用

摘要：肽核酸（PNA）是近年發展起來的一種脫氧核糖核酸類似物，其可通過與DNA以及RNA進行特異性結合，制成探針，被稱為PNA探針。相較于DNA探針，其特異性以及穩定性均有所增加，可以大幅度提高微生物學檢測的靈敏度，也可以提高診斷效率，對PNA探針進行繼續研究十分具有臨床價值。

關鍵詞：肽核酸；探針；微生物；診斷

肽核酸是1991年由丹麥科學家Nielsen等設計的以中性酰胺鍵為骨架的DNA類似物，其骨架結構單元為（2-氨乙基）甘氨酸，堿基部分通過亞甲基碳基與主骨架氨基連接，可以與DNA特異性結合[1]。其骨架為電中性，與DNA-DNA或RNA-DNA相比不存在靜電排斥作用，因此具有很高的核酸親和性及熱穩定性。目前根據不同微生物的特點和診斷方法的要求進行微生物快速診斷主要有三種策略：①分離培養后快速鑒定；②短時間富集后檢測；③直接檢測。針對rRNA的PNA探針已經成功運用于以上三種方式，而且能夠提供了更快速準確的結果，并在此基礎上發展出多種檢測模式，如基于玻片的熒光原位雜交，基于濾膜的熒光原位雜交、化學發光原位雜交、液相雜交、Q-PNA PCR等。隨著以rRNA多態性為基礎的微生物分類學的發展，兩者結合正在共同推進微生物診斷技術的快速發展。

1 PNA技術

1.1 PNA探針 PNA特殊的結構和性質使其作為探針在微生物診斷領域顯示出獨特的優勢。PNA探針一般是指序列長度為13～18bp的寡聚PNA，其長度比DNA探針短。電中性的骨架使PNA具有比DNA更高的雜交親和性和堿基配對特異性，并可以通過單堿基錯配來分辨不同的核酸序列。PNA探針雜交條件也比DNA探針溫和，低離子濃度下也可以發生雜交，且能夠抵抗核酸酶和蛋白酶的降解。

1.2自身報告的PNA探針 LightUp探針和LightSpeed探針是熒光標記的PNA探針，LightUp探針是偶聯有唾哇橙染料的PNA探針，LightSpeed探針是雙標記的PNA探針，即在PNA分子的兩端分別聯上熒光染料和淬滅劑。在水溶液環境中，LightSpeed探針的構象使熒光染料和淬滅染料彼此靠的很進，熒光被淬滅。當探針與靶序列結合時，熒光劑和淬滅劑在空間上得到分開，使PNA的熒光染料發出熒光。LightUp探針在非雜交狀態下是內在非熒光的，當探針與靶序列結合時發出熒光，但這種發光效應與PNA的序列有很大程度的相關性，目前這種關系機制還沒有完全清楚。這兩種探針都可以用于實時PCR分析，并且具有很高的敏感性和特異性。

1.3 PNA阻斷探針 PNA探針與DNA探針相比，特異性雖然明顯增強，但其特異性還不能足夠精確區分與靶標分子親緣關系非常接近的序列分子[2]。在這種情況下，我們可以通過非標記的阻斷探針來屏蔽非靶標序列，減少標記探針的錯誤結合，從而提高其特異性。PNA阻斷探針有時和化學封閉物同時使用，以消除標記探針與膜的非特異結合，提高特異性?？傊?，PNA阻斷探針僅與標記探針有微弱的結合靶標的競爭效應。我們可以調整阻斷探針的濃度，不斷優化雜交方案，從而使特異性達到最佳。

2 肽核酸探針技術在微生物檢測領域的應用

2.1肽核酸探針技術應用于乙型肝炎病毒檢測 有研究人員[3]根據從Genebank上下載的HBV基因組序列，用Alignment軟件進行對比分析，選取HBV的保守序列，根據設計引物的一般原則，設計了擴增產物，從Pro.mega公司購買dNTP，自主生產Taq酶，乙型肝炎病毒PCR診斷試劑盒購自安普利生物工程有限公司。分別進行單堿基突變檢測和HBV DNA的檢測，檢測結果顯示無論用DNA作為探針還是用PNA作為探針檢測單堿基突變，都可根據雜交信號的比值得到正確的雜交結果。而PNA作為探針時對鹽濃度的要求更低，雜交信號更強，陰性、陽性探信號強度的對比也更強烈；DNA做探針時為得到相對較好的結果，對洗脫條件的要求更苛刻。而檢測HBV DNA的結果顯示，用PNA探針檢測乙肝患者（大三陽）血清16份，所得結果與使用乙型肝炎病毒PCR診斷試劑盒所得結果完全相同，其中有1例使用試劑盒確定為極弱的陽性，但通過本方法檢測為明顯陽性。肽核酸探針對核酸鏈間錯配的強識別能力使得該技術在乙型肝炎病毒的檢測中發揮重大作用。

2.2肽核酸探針技術應用于鼠疫耶爾森氏菌的檢測 鼠疫是由鼠疫耶爾森氏菌（Yersinia pestis，以下簡稱鼠疫菌）引起的，它是傳統生物戰劑之一，是恐怖分子用于制造生物恐怖的首選微生物之一，因此對該菌的快速檢測與鑒定具有重要意義。F1抗原是鼠疫菌中發現最早的抗原，也是該菌最重要的保護性抗原，因其具有非常高的特異性，c礬基因是Fl抗原的結構基因，編碼Fl抗原的亞單位，讀碼結構為510個核苷酸。

有實驗[4，5]以鼠疫菌DNA作為陽性對照進行特異性試驗，檢測了7種非鼠疫菌株，包括金黃色葡萄球菌、假結核耶爾森氏菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、枯草芽胞桿菌、類白喉棒狀桿菌、布魯氏菌，結果顯示只有陽性對照鼠疫菌和傷寒沙門氏菌的信號高于空白對照，其他菌種對應的信號均低于空白對照。出現此結果可能的原因是探針與磁珠或c筘顆粒結合的效率不可能達到100%，使部分顆粒表面缺少探針的覆蓋而產生非特異的結合，所以這種檢測方法的靈敏度和特異性較熒光定量PCR和常規PCR方法有一定的差距，但作為一種新技術，經過改進，且在研制專用單分子檢測儀器的基礎上，本方法有望成為不需要PCR擴增、檢測靈敏度可與PCR媲美

2.3其他肽核酸探針技術在微生物檢測中應用 目前，美國緬因州立大學的研究人員[6]采用有毒赤潮生物Alexandrium藻作為目標藻。采用半自動的三明治雜交方式，研究比較了雙標記的PNA探針和相應的雙標記DNA探針及三標記DNA探針的檢測效果，結果表明，PNA探針的檢測效果明顯高于DNA探針。此外，針對病原微生物的分子化石一rRNA的序列，設計PNA探針并使之與熒光原位雜交（FISH）技術相結合可有效用來分離、鑒定病原微生物。目前已經有利用該技術從血培養的標本中分離、鑒定出了金黃色葡萄球菌舊引的實驗。

參考文獻：

[1]李可，張曉峰，王忠才，等.肽核酸探針在微生物診斷領域的應用進展[J].微生物學通報，2012，39（7）：1000-1006.

[2]葉乃芳，王中新.16SrRNA及相關技術用于臨床細菌鑒定的研究進展[J].國際檢驗醫學雜志，2015，4：520-522.

[3]于曉云.細菌性角膜潰瘍的醫院流行病學、誘因和微生物診斷分析[J].中國醫藥指南，2013，25：147-148.

[4]孫美娟，劉軍賢，王雪，等.拉曼光譜技術在微生物學中的應用[J].生物技術通報，2012，10：63-68.

[5]郭輝，王翠娥，彭剛，等.VITEK2 Compact全自動微生物分析系統在嚙齒類細菌學檢測中的應用[J].實驗動物科學，2014，31（2）：16-19.

[6]張麗，徐英春.MALDI-TOF MS在臨床微生物實驗室的應用研究進展[J].中國感染與化療雜志，2013，13（3）：226-231.編輯/安樺