借助ITS序列用GFP標記巴西橡膠樹棒孢霉落葉病病原菌

劉曉妹等

摘 要 由多主棒孢菌（Corynespora cassiicola）侵染引起的巴西橡膠樹棒孢霉落葉病是影響橡膠樹產膠量的主要病害之一。為了開展該病原菌在活體葉片中的病理學研究，本實驗將綠色熒光蛋白gfp基因表達盒插入了多主棒孢菌經定點突變后的ITS序列中，構建了重組質粒pITGH，并經PEG介導轉化了原生質體，獲得了GFP標記的多主棒孢菌轉化子，所獲得的轉化子經過連續7次轉接培養后仍能在分生孢子、分生孢子梗、芽管和菌絲中穩定地發出強烈的綠色熒光，其生長特性和致病性與野生菌株無明顯差異。

關鍵詞 巴西橡膠樹；多主棒孢菌；綠色熒光蛋白；ITS定點突變；標記

中圖分類號 S432.4 文獻標識碼 A

Abstract Corynespora leaf fall（CLF）disease， caused by the fungal pathogen Corynespora cassiicola， is a major disease of rubber tree（Hevea brasiliensis）that affects the production of natural rubber. The objective of this paper was to provide desired materials for studing pathogenesis on living leaves. The green fluorescent protein（GFP）-expression vector pITGH was constructed by inserting a gfp cassette into rDNA-ITS of site-directed mutagenesis. C. cassiicola protoplasts were transformed by pITGH using a PEG-mediated method. A GFP-tagged transformat was gained. The transformation was efficient， and GFP expression remained stable for at least seven subcultures with fluorescence clearly visible in both the hyphae and spores. The transformed isolate also retained its pathogenicity and growth pattern， both similar to those of wild type. This result would be useful for understand biology，observing infection process， predicting the CLF disease and evaluating resistance of H. brasiliensis to C. cassiicola by means of leaf colonization studies.

Key words Hevea brasiliensis； Corynespora cassiicola； GFP； rDNA-ITS of site-directed mutagenesis； Marker

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.022

巴西橡膠樹是重要的熱帶作物之一，其產品天然橡膠與鋼鐵、石油、煤炭并列為四大工業原料。由多主棒孢菌[Corynespora cassiicola（B. & C.） Wei]侵染引起的巴西橡膠樹棒孢霉落葉病是影響橡膠樹產膠量的主要病害之一[1]。該病菌能侵染為害280多種植物[2]。關于該病菌的生物學特性、遺傳多樣性以及病害防治等方面已開展了較多研究[3-4]，而且已深入到分子研究水平，已報道了4個致病相關基因CCK1[3]、CMP1[4]、CCHog1[5]和cas[6]，但有關該菌GFP標記的研究國內外尚未見報道。

與傳統的組織印跡法、放射性標記核酸探針法、GUS染色法等非活體檢測方法相比，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）因發光穩定、對活細胞無傷害和不需添加外源底物，就可以在活細胞中實現實時動態監測等優點[7]，利用GFP標記靶標植物病原菌成為了目前研究病原菌與寄主之間互作的……