鳳凰單叢茶樹資源遺傳多樣性的ISSR分析

吳清等

摘 要 采用ISSR分子標記技術對48份鳳凰單叢茶品種（系）進行了遺傳多樣性分析。選用10個多態性高、分辨力強的ISSR引物分別對供試材料基因組DNA進行擴增，共獲得121個位點，其中多態位點帶98個，多態位點比率（PPB）為81.0%。品種（系）之間的遺傳相似系數變化范圍在0.590 9～0.967 4之間。UPGMA聚類分析結果表明，在GS值為0.792的水平上供試材料可劃分為7大類，其親緣關系遠近與地理來源關系不大且與香味類型沒有必然的聯系。

關鍵詞 ISSR分子標記；鳳凰單叢茶；遺傳多樣性

中圖分類號 S571.1 文獻標識碼 A

Abstract ISSR molecular markers were used to analyze the genetic polymorphism of 48 Fenghuang-Dancong tea plant germplasms. Using 10 primers， we amplified 121 bands， of which 98 bands are polymorphic， and the average percentage of polymorphic bands was 81.0%. The genetic similarity among all the tested tea plant germplasms ranged from 0.590 9 to 0.967 4. Based on the genetic similarity and the UPGMA cluster， all the 48 accessions were clustered to 7 groups on the genetic similarity level of 0.792. The dengrogram indicated that the genetic of 48 tested tea plant germplasms had no certain relation with the geographical origin and aroma type.

Key words ISSR markers； Fenghuang-Dancong Tea； Genetic diversity

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.009

鳳凰單叢茶屬烏龍茶類，產于“中國烏龍茶之鄉”的廣東省潮安縣鳳凰鎮，由茶農歷代沿習單株優選、單株培育、單株采制的傳統栽培方式和獨特的加工工藝制作而成的具有天然花香和特殊韻味品質的烏龍茶，現已形成了具有區域特色的品種（系）體系，享有“中國的國寶”之美譽[1]。茶業產量及品質提高依賴于茶樹優良品種的選育，而鳳凰單叢品種（系）資源繁多，且主要以香型為主線將其歸類，存在同一香型中包含多個品種（系），同型品種（系）間的品質參差不齊的現象，加之茶樹通常是通過雜交育種，從而使各品種（系）之間的親緣關系混亂，本底不清，遺傳背景不明確，極大地妨礙了品種（系）之間的親緣歸類、育種親本的選配和種質資源的創新和利用。

ISSR（Inter-Simple Sequence Repeat）是一種以基因組中常出現的SSR本身設計成錨定引物為單引物并基于PCR技術的簡單序列重復區間擴增多態性分子標記，具有無需預先知道基因組序列信息、快速、穩定、多態性豐富、重復性強及成本低等優點[2]。該技術廣泛應用于植物的種質資源鑒定和親緣關系分析，在茶樹種質資源上的應用也有相關報道[3-8]。本研究利用ISSR分子標記技術，從DNA分子水平對所收集的48份鳳凰單叢茶樹品種（系）進行遺傳多樣性及親緣關系研究，為鳳凰單叢茶樹品種（系）的親緣歸類、保護及利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的48份鳳凰單叢茶樹樣品及來源詳見表1。取一芽兩葉置于盛有硅膠的封口袋中，-20 ℃保存備用。ISSR引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，Taq聚合酶、dNTPs等購自大連寶生物TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA的提取 參照Sue Porebski[9]、陳昆松[10]的方法，采用改良的CTAB（2% β-巰基乙醇、3%聚乙烯吡咯烷酮）法進行基因組DNA提取。

1.2.2 ISSR-PCR擴增和產物檢測 ISSR-PCR擴增反應在TaKaRa TP600梯度PCR儀上進行，經過比較和優化，確定反應體積為20 μL，PCR組分如下：2 μL 10×PCR buffer、40 ng/μL模板DNA、150 μmol/L dNTPs、1.5 mmol/L MgCl2、引物0.3 μmol/L、1.0 U Taq酶。擴增程序為：94 ℃預變性7 min；94 ℃變性1 min，特定溫度退火45 s，72 ℃延伸120 s，38個循環；最后72 ℃延伸10 min。擴增產物用含有0.5 μg/mL EB的1.8%瓊脂糖凝膠（1×TAE緩沖液）以5 V/cm電泳3 h，電泳結束用VILBER LOURMAT公司凝膠成像系統照相并保存。

1.3 數據處理

對保存的圖片進行人工方法讀帶，將電泳圖上可重復的、清晰的條帶賦值為“1”，同一電泳遷移位置無帶或不易分辨的弱帶賦值為“0”，建立原始數據矩陣。使用NTSYspc2.10e軟件，根據Nei等[11]采用DICE系數計算供試材料間的遺傳相似系數，并按SAHN鄰接法對供試材料進行UPGMA遺傳相似性聚類分析，并繪制樹狀聚類圖[5]。

2 結果與分析

2.1 ISSR擴增產物多態性

從103條ISSR引物中篩選出10條能在特定的退火溫度下擴增條帶具有多態性高、重復性強、背景清晰的引物用于ISSR-PCR反應，10條引物共擴增出121個位點，其中多態性位點數為98個，平均多態性位點百分率（PPB）為81.0%（表2）。不同引物擴增的位點數7～15個不等，平均每個引物擴增12.1個位點和9.8個多態位點，多態位點百分率最高為92.3%，最低為70%（表2）。擴增產物片段大小介于250～2 000 bp之間，圖1為引物UBC880擴增的結果。

2.2 品種（系）間親緣關系和聚類分析

根據條帶統計的數據矩陣，分析供試材料間的遺傳相似性系數，結果表明，48份鳳凰單叢茶樹資源品種（系）之間的遺傳相似性系數范圍介于0.590 9～0.967 4之間，平均遺傳相似性系數為0.795 0。其中南馥通天香（45號）與兄弟茶（46號）之間的相似系數最高（0.967 4），親緣關系最近。而玉蘭香（23號）與鴨屎香（38號）之間的相似系數最低（0.590 9），親緣關系最遠，顯示它們彼此存在較大的遺傳差異。

依據種質間的Neis遺傳相似性系數對48份鳳凰單叢茶樣品進行UPGMA聚類分析，結果（圖2）顯示，在相似性系數閾值為0.792時，可將48份樣品分為7大類群，第Ⅰ類群包括宋種蜜蘭香等33份品種（系），第Ⅱ類群包括蓋山香、夜來香、大紅、石古坪烏龍、毛尖5個品種（系），第Ⅲ類群包括鋸剁仔、石古坪杏仁香2個品種（系），第Ⅳ類群包括石古坪黃梔香、官目石芝蘭香、油茶3個品種（系），第Ⅴ類群包括宋種1號、田料埔長葉黃梔香2個品種（系），第Ⅵ類群包括玉蘭香、官目石玉蘭香2個品種（系），第Ⅶ類群包括鴨屎香1個品種（系）。其中第Ⅰ類群還可以分為兩個亞類群，第Ⅰ亞類群包括宋種蜜蘭香、佚名、大庵玉蘭、南馥通天香、兄弟茶、竹葉、大烏葉、大烏葉2號、原種水仙、南馥蜜蘭香、桂花香、白葉、鳥嘴1號、鳥嘴2號、田料埔圓葉黃梔香、貢香、黃金葉和柚花香18個品種（系），第Ⅱ亞類群包括仙豆葉、區山塘八仙過海、花香單叢、清泉香、大坪芝蘭香、通天香、柚葉、宋種黃梔香、楊梅葉、大庵芝蘭香、蛤蛄螻、大庵肉桂、官目石肉桂香、雞籠刊和茉莉香15個品種（系）。根據聚類樹狀圖結果表明，供試的鳳凰單叢茶種質之間的親緣關系與地理來源、海拔高度及香味類型沒有必然的對應關系，例如同一香型、命名相似的大坪芝蘭香、大庵芝蘭香、官目石芝蘭香3個種質并不完全聚為同一類群，大庵玉蘭、玉蘭香、官目石玉蘭香3個種質也并不完全聚為同一類群，田料埔圓葉黃梔香、田料埔長葉黃梔香、宋種黃梔香、石古坪黃梔香4個種質分別聚類于不同類群中。

3 討論與結論

本研究選用10條多態性高、分辨力強的ISSR引物對收集到的48份鳳凰單叢茶種質DNA進行擴增，得到鳳凰單叢茶ISSR帶型表現出較高的多態性，多態性帶型占81.0%，遺傳相似系數介于0.590 9～0.967 4間，遺傳相似性變幅為0.376 5，而蕭力爭[12]等采用AFLP標記法分析34份鳳凰單叢古茶樹資源遺傳多樣性得出的多態性比率為79.3%，遺傳相似性系數變化范圍在0.13～0.49之間，遺傳相似性變幅為0.36，這表明ISSR分子標記是評估鳳凰單叢茶遺傳多樣性的有效方法，同時也驗證了ISSR分子標記具有快速、穩定、多態性豐富、重復性強等特點[13-15]。Liu[3]等采用ISSR標記分析134云南茶樹資源遺傳多樣性，分析得出其相似系數范圍為0.445～0.819，變幅為0.374，說明潮州鳳凰鎮鳳凰單叢茶樹資源之間具有較寬的遺傳基礎，但也存在品種（系）間的遺傳距離較小、親緣關系較近，只有少數品種（系）表現出較為顯著的遺傳分化，如采摘于南馥茶園的南馥通天香與兄弟茶之間的遺傳相似性最高，可能是種植時品種（系）弄混，可將這兩個品種（系）作為復份材料保存，而在聚類上，鴨屎香與其他品種（系）單獨分開，則有待于進一步鑒定分析。造成這種現象的原因可能是因為長期以來，鳳凰單叢茶主要以香型歸類，茶農藉此在不同地域之間經常相互引種栽培，出現許多同名異物或同物異名的現象，最終導致品種（系）的名稱和分類十分混亂。然而本研究采用ISSR標記方法分析得出，鳳凰單叢茶種質間的親緣關系與其地理來源及香味類型沒有必然的聯系，此研究結果跟蕭力爭等[12]采用AFLP標記方法分析得出來結果一致。在類聚上，大烏葉和大烏葉2號，鳥嘴1號和鳥嘴2號，這種遺傳相似性高，卻體現出微小的遺傳分化，這可能是因為是茶樹本身為高度雜合體且是異花授粉，在長期雜交演化過程中能產生很多不連續的變異，加上茶樹芽葉本身具有突變的可能，同時長時間移植后新環境對品種（系）的遺傳信息也可能發生一定的影響[3，16]。

因此，為了保證鳳凰單叢茶種質的優良品質，必須明確鳳凰單叢茶種質間的遺傳背景，避開原來香型歸類的影響，根據ISSR分子標記分析結果有助于指導選配工作，選擇親緣關系較遠的品種（系），增加其子代的遺傳變異，選育出具有雜種優勢、綜合性狀好的優良品種（系）。

參考文獻

[1] 葉漢鐘， 黃柏梓. 鳳凰單叢[M]. 上海： 上海文化出版社， 2010.

[2] Zietkiweica E， Rafalski A， Labuda D. Genome fingerprinting by simple sequence repeat（SSR）-anchored poly-merase chain reaction amplification[J]. Genomics， 1994， 20（2）： 176-183.

[3] Liu B Y， Li Y Y， Tang Y C， et al. Assessment of Genetic Diversity and Relationship of Tea Germplasm in Yunnan as Revealed by ISSR Markers[J]. Acta Agronomica Sinica， 2010， 36（3）： 391-400.

[4] Modal T K. Assessment of genetic diversity of tea（Camellia sinensis（L.）O.Kuntze）by inter-simple sequence repeat polymerase chain reaction[J]. Euphytica， 2002， 128： 307-315.

[5] Yao M Z， Chen L， Liang Y R. Genetic diversity among tea cultivars from China， Japan and Kenya revealed by ISSR markers and its implication for parental selection in tea breeding programmes[J]. Plant Breeding， 2008， 127： 166-172.

[6] 郭春芳， 唐玉海， 孫 云， 等. 茶樹種質資源遺傳多樣性的ISSR分析[J]. 熱帶作物學報， 2008， 29（2）： 181-186.

[7] 林鄭和， 陳榮冰， 陳常頌， 等. ISSR分子標記在茶樹遺傳關系分析中的初步應用[J]. 茶葉科學， 2007， 27（1）： 45-50.

[8] 季鵬章， 汪云剛， 張 俊， 等. 茶組植物親緣關系的ISSR分析[J]. 西南農業學報， 2009， 22（3）： 584-588.

[9] Porebski S， Bailey L G， Baum B R. Modification of a CTAB DNA extraction protocol for plants containing high polysaccharide and polyphenol components[J]. Plant Molecular Biology Reporter， 1997， 15（1）： 8-15.

[10] 陳昆松， 李 方， 徐昌杰， 等. 改良CTAB法用于多年生植物組織基因組DNA的大量提取[J]. 遺傳， 2004， 26（4）： 529-531.

[11] Nei M， Li W H. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases[J]. Proc Natl Acad Sci， 1979， 76（10）： 5 269-5 273.

[12] 蕭力爭， 晏嫦妤， 李家賢， 等. 鳳凰單叢古茶樹資源的遺傳多樣性AFLP分析[J]. 茶葉科學， 2007， 27（4）： 280-285.

[13] Lan D Godwin， Elisabeth A B Aitken， Lawrence W. Smith. Application of inter simple sequence repeat（ISSR） markers to plant genetics[J]. Electrophoresis， 1997， 18： 1 524-1 528.

[14] McGregor C E， Lambert C A， Greyling M M， et al. A comparative assessment of DNA fingerprinting techniques（RAPD， ISSR， AFLP and SSR）in tetraploid potato（Solanum tuberosum L.）germplasm[J]. Euphytica， 2000， 113： 135-144.

[15] Pradeep Reddy M， Sarla N， Siddiq E A. Inter simple sequence repeat（ISSR）polymorphism and its application in plant breeding[J]. Euphytica， 2002， 128： 9-17.

[16] 趙尹強， 陳朝進， 劉志剛， 等. 茶樹芽葉的變異[J]. 中國茶葉， 2011（2）： 8-9.