基于葡萄柚葉片離體再生體系的研究

陶燕藍　藍增全　吳田

摘 要 以10個葡萄柚品種種子萌發的無菌苗葉片為外植體，研究葡萄柚的離體再生體系。結果表明：在MS+1.0 mg/L 2，4-D+6%蔗糖培養基上，8個葡萄柚品種能誘導出愈傷組織，其中“星路比”品種誘導率最高為46.67%，將誘導的愈傷組織轉移至相同培養基中可繼代增殖；“帕利斯”、“星路比”、“泰國種”3個品種的葉愈傷組織接種于MS+3.0 mg/L 6-BA分化培養基上可分化出叢生芽，這些叢生芽在MS+0.2 mg/L 6-BA培養基上平均可增殖4～6個芽；叢生芽在1/2 MS+1.0 mg/L IBA生根培養基上可誘導出不定根。煉苗后，田間移栽成活率為78.18%。為后續葡萄柚良種選育及遺傳轉化體系的建立奠定基礎。

關鍵詞 葡萄柚；再生植株；愈傷組織；不定芽

中圖分類號 Q943.1 文獻標識碼 A

Abstract The leaves of aseptic seedlings from the seeds of ten grapefruit varieties as explants were used to establish the in vitro regeneration system of grapefruit. The results showed that the callus of eight grapefruit varieties were observed in the medium MS+1.0 mg/L 2，4-D+6% sugar， and “Star Ruby”had the highest callus induction frequency， which is 46.67%. The multiplication medium of the callus was the same medium. The medium of the differentiation of adventitious buds of three grapefruit varieties“Perlist”“Star Ruby”and “Thailand” was MS+3.0 mg/L 6-BA. The medium for multiplication of the regeneration buds was MS+0.2 mg/L 6-BA， and the rooting medium was 1/2 MS+1.0 mg/L IBA. The survival rate of regenerative plant was 78.18%. In order to provide useful references for the breeding and the application of genetic transformation technique in grapefruit.

Key words Citrus paradisi Macf.；Regenerative plant；Callus；Adventitious bud

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.007

葡萄柚（Citrus paradisi Macf.）是蕓香科柑橘屬亞熱帶常綠果樹，為甜橙和柚的天然雜交種，是世界柑桔類四大類群之一[1]，因果實懸掛成串，簇生如葡萄，故稱葡萄柚[2]。葡萄柚起源于西印度群島的巴巴多斯，在歐美地區大量種植，中國種植較晚[3]。葡萄柚的營養價值豐富、果實柔嫩、風味獨特，既可鮮食，又可加工制成罐頭、果汁及色拉等原料[4-6]，越來越受到世界各國的生產者和消費者的喜愛，因此發展葡萄柚種植具有可觀的前景[7]。

葡萄柚主要通過接穗嫁接栽培[8]，不僅費工費時，而且易造成品種退化，給葡萄柚的生產帶來損失。通過建立高效的離體再生體系，能有效克服傳統繁殖方式的弊端，為葡萄柚的原體苗木遺傳育種、基因轉化及品種改良提供重要基礎。葉片是植物光合作用的重要器官，又是某些植物的繁殖器官，很多植物的葉片具有比較強的再生能力，能夠產生再生植株，葉片離體培養在植物器官培養中占有一席之地，目前已從水稻、小麥、油菜、番茄、楊樹、菊花、百合、獼猴桃、桃等百余種植物的葉片培養中獲得了再生植株[9-10]。周夢春等[11]用琯溪蜜柚、沙田柚和江津柚的葉片誘導出了愈傷組織。鄧群仙[12]以酸柚、中江柚的葉片為外植體時，始終未能誘導出芽。在果樹離體葉片培養中，對愈傷組織的誘導和生長影響效果比較顯著的是2，4-D[13]。黃濤等[14]通過研究沙田柚葉片離體再生的影響因素表明，2，4-D可誘導沙田柚葉片愈傷組織的形成。

云南省于2002年初次從美國引進9個葡萄柚品種（品系），并相繼開始了相關研究[15-17]。目前，關于葡萄柚離體再生培養方面已有探索，以鄧肯葡萄柚實生苗上胚軸為材料進行培養，成功獲得了再生植株[18-19]。但以葡萄柚葉片為外植體進行離體再生方面的研究國內尚未見系統報道。本試驗擬采用10個葡萄柚品種的組培苗葉片為試材，對其進行離體再生培養，并為進一步的無性變異體篩選和采用基因工程進行遺傳改良奠定良好基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料是從美國引進嫁接栽培在云南省西雙版納州普文鎮試驗林場的9個葡萄柚品種，分別為火焰（Flame）、矮化（Genetic Dwarf）、亨路比（Henderson Ruby）、哈路比（Hudson Foster）、帕利斯（Perlist）、瑞路比（Ray Ruby）、里德馬敘（Reed Marsh）、里約紅（Rio Red）、星路比（Star Ruby），以及泰國種（Thailand）葡萄柚的種子，以其種子萌發的無菌苗為試驗材料。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的培養 取新鮮飽滿的葡萄柚種子，剝去外種皮（圖1），然后在超凈工作臺上經5%次氯酸鈉滅菌5 min后，用75%的酒精處理30 s，然后用無菌水清洗3～5次，置于濾紙上吸干多余的水分，最后接種于MT培養基（不加特殊說明時，培養基蔗糖濃度為3%，瓊脂為0.7%，pH值5.8）中培養。培養室恒溫（25±2）℃，先采用暗培養，待芽長至1 cm左右時將其光照培養，光照為100 μmol/（m2·s），光照時間為12 h/d。當培養40 d后，取葉片用于愈傷組織誘導。

1.2.2 愈傷組織誘導 取種子萌發較快、長勢較好的星路比葡萄柚葉片接種于以下3種培養基上培養：MS+1.0 mg/L NAA+6%蔗糖+0.6%瓊脂、MS+1.0 mg/L 2，4-D+6%蔗糖+0.6%瓊脂、MS+1.0 mg/L 6-BA+6%蔗糖+0.6%瓊脂，以篩選出葡萄柚葉片愈傷組織誘導最佳的培養基配方。為研究不同品種（基因型）對葉愈傷組織誘導培養基的敏感性，分別取其它9個葡萄柚品種無菌苗葉片，剪去葉尖和葉緣，剪成1 cm×1 cm方片，正面向上放于篩選出的最佳誘導愈傷培養基上誘導培養。每瓶培養基中接種5塊，每個品種接種6瓶。培養過程中每5 d觀察1次，40 d后統計愈傷組織的生長狀況。

1.2.3 不定芽誘導及增殖 篩選出敏感性強的葡萄柚品種，對其葉愈傷組織進行分化誘導。分化不定芽誘導培養基有以下3種：MS+1.0 mg/L 6-BA、MS+2.0 mg/L 6-BA、MS+3.0 mg/L 6-BA，培養條件同1.2.1。培養50 d后統計每塊愈傷組織上不定芽的數量，并計算不定芽分化率和平均每個外植體分化芽數。分化出的不定芽轉至MS+0.2 mg/L 6-BA培養基上進行增殖培養。

1.2.4 不定根誘導 不定芽生長至2～4 cm時，從莖基部切下接種于1/2 MS+1.0 mg/L IBA（3%蔗糖、0.65%瓊脂、pH5.8）的生根培養基上（參照本研究小組擴繁體系試驗），誘導無菌苗生根，獲得完整植株。

1.2.5 煉苗移栽 已生根的試管苗在移栽前先打開封口膜，常溫下放置2 d，對其進行馴化以提高組培苗的適應能力。2 d后取出并小心地洗去培養基，移栽到蛭石與沙壤土對半的營養缽中，置于大棚內遮蔭培養1周后正常光照培養，每2～3 d進行噴水保濕，棚內恒溫（25±2）℃，濕度保持60%～75%，50 d后統計成活率。

1.3 評價指標與數據調查

所有數據均采用SPSS11.5軟件、Excel2003進行分析。愈傷組織誘導率、不定芽分化率和平均每個外植體分化芽數根據以下公式計算：

愈傷誘導率=（產生愈傷組織外植體數/接種外植體數）×100%

不定芽分化率=（分化不定芽的外植體總數/接種外植體總數）×100%

平均每個外植體分化芽數=外植體分化不定芽總數/分化不定芽外植體數

2 結果與分析

2.1 不同激素對“星路比”葉片愈傷組織誘導的影響

由表1可知，“星路比”葉片在MS+1.0 mg/L 2，4-D培養基上的愈傷誘導率最好，為48.89%，愈傷組織致密有光澤，較肥大（圖2-A～C）；在MS+1.0 mg/L NAA培養基上可誘導出少量淡黃色愈傷，愈傷誘導率為15.56%；在MS+1.0 mg/L 6-BA培養基培養初期葉片卷縮，切口處逐漸褐化成枯狀，部分葉片呈白化狀，最后未形成愈傷。

2.2 不同葡萄柚品種葉片愈傷組織的誘導及增殖

外植體接種后放于培養室培養，從培養過程中發現，外植體接種20 d后，其切口處卷縮出現少量乳白至淡黃色致密的愈傷組織；40 d后，由切口處延伸的愈傷組織逐漸變大，可見愈傷組織慢慢變至乳白略呈淡黃綠色，結構致密，質地較硬，表面濕潤，晶瑩光亮；此時的愈傷組織轉至相同培養基上可進行繼代增殖，能有效保持其快速生長的狀態。但隨著培養時間的延長，愈傷組織顏色不斷加深，表面局部出現褐色，外觀干燥，呈老化狀態，用這樣的愈傷組織繼代培養，不能保持其快速生長的狀態，增殖數量有限，且衰敗速度也快。因此產生的愈傷組織應在培養20 d左右處于新鮮健壯時及時繼代培養。

為保證增殖數量，繼代之后的愈傷組織每30 d繼代1次。由表2可知，在MS+1.0 mg/L 2，4-D+6%蔗糖培養基上，“星路比”葉片愈傷組織誘導率較高，為46.67%；“火焰”和“亨路比”愈傷組織誘導率較低，為16.67%。在相同培養基上，“矮化”和“瑞路比”在培養10 d左右時，切口開始褐化，20 d時，部分切口長出微量的淡黃綠色愈傷組織并逐漸褐化，最后未獲得誘導愈傷；其余8個葡萄柚品種葉片愈傷組織誘導率排序為：星路比（46.67%）>泰國種（36.67%）>里德馬敘（33.33%）>帕利斯（26.67%）>哈路比（23.33%）>里約紅（20.00%）>火焰和亨路比（16.67%）（表2）。“火焰”、“亨路比”、“哈路比”、“帕利斯”、“里德馬敘”、“里約紅”、“星路比”、“泰國種”8個品種誘導出的乳白略呈淡黃綠色致密堅硬的愈傷組織在相同培養基上可進一步增殖。由于“火焰”、“亨路比”、“哈路比”、“里德馬敘”、“里約紅”5個品種產生的愈傷組織較小，只零星分布于卷曲葉片的周圍，增殖速度也較慢；“帕利斯”、“星路比”、“泰國種”3個品種愈傷組織量較多，因此接下來選用這3個品種進行叢生芽的誘導試驗。

2.3 不同葡萄柚品種葉片愈傷組織不定芽的分化及增殖

由表3可知，由“帕利斯”、“星路比”、“泰國種”3個葡萄柚品種葉片誘導出的乳白略呈淡黃綠色、致密、堅硬愈傷組織在MS+1.0 mg/L 6-BA、MS+2.0 mg/L 6-BA、MS+3.0 mg/L 6-BA 3種培養基上均可分化出不定芽。3個品種在分化芽數、不定芽分化率和分化芽生長情況上所呈現的趨勢都是在3.0 mg/L 6-BA處理下的誘導率高于1.0 mg/L和2.0 mg/L處理下的誘導率。其中“星路比”葉愈傷組織不定芽分化率最高，為48.00%，平均每個外植體分化芽數約為3.2；“泰國種”分化率最低，為17.50%，平均每個外植體分化芽數約為1.3。3個品種之間分化芽數及不定芽分化率差異不顯著。由于基因型不同，3個品種不定芽分化率和平均每個外植體分化芽數及生長狀態有所不同。“星路比”芽增殖方式為叢生和單生，再生芽健壯，長勢較好（圖2-D）；“帕利斯”芽繁殖方式多為單生，在高濃度6-BA處理下為叢生，再生芽長勢一般（圖3-B）；“泰國種”再生芽增殖方式主要為叢生，但芽弱小，生長較慢（圖3-E）。愈傷組織上分化出的不定芽轉移到MS+0.2 mg/L 6-BA培養基上增殖培養時，可平均增殖4～6個芽（圖4）。

2.4 不定根的誘導

將長至2～4 cm的不定芽，從莖基部切下接種到生根培養基上，置于光照條件下進行培養。結果表明，3個葡萄柚品種的不定芽均可誘導出不定根。“泰國種”的生根率最高，為87.88%；“帕利斯”的較低，為66.67%（表4）。培養30 d后，從不定梢的基部生出1～3條乳白色不定根。“泰國種”的生根時間早于“帕利斯”和“星路比”，10 d左右就有根長出（圖3-F）。

2.5 煉苗移栽

“帕利斯”、“星路比”、“泰國種”3個品種通過煉苗具有一定適應性后移栽至蛭石與沙壤土對半的營養缽上，其成活率約為78.18%。移栽初期，由于組培苗的葉子保濕反光性差，易失水焉萎，需經常澆水以保持濕度。20 d左右組培苗抽出新葉，50 d后隨著根系增粗和伸長，植株增高明顯，葉片多且綠。“泰國種”的植株表現優于“帕利斯”和“星路比”。

3 討論與結論

培養基中的激素被認為是葉片再生的最重要因素。本試驗首先以“星路比”葉片為培養對象，在單獨添加1.0 mg/L 2，4-D、1.0 mg/L NAA的培養基上均可產生愈傷組織，但2，4-D的誘導率優于NAA的誘導率，在單獨添加1.0 mg/L 6-BA的培養基上未獲得愈傷組織，說明2，4-D更適合葡萄柚葉片愈傷組織的誘導。黃濤等[14]和周夢春等[20]的研究結果也表明1.0 mg/L 2，4-D與6%蔗糖處理的葉片愈傷組織誘導率最高。葉片離體再生不定芽的發生通常有2種方式，一種是先誘導形成愈傷組織，然后從愈傷組織分化產生不定芽，另一種則是誘導葉片上直接長出不定芽[21]。有研究結果顯示，草莓通過誘導葉片上直接長出不定芽的方式完成離體葉片再生體系[22-23]，越橘葉片離體再生方式同樣是在葉片上直接長出不定芽[24]，昌紅蘋果離體葉片不定芽再生方式則經過愈傷后形成[25]。賀紅等[26]以紅江橙葉片為外植體進行研究時，出芽途徑以直接出芽為主。本研究結果中發現，葡萄柚離體葉片離體再生不定芽的方式需要誘導形成愈傷，再在愈傷組織上分化產生不定芽。

葉片的離體再生能力與基因型有著直接的關系，外植體基因型是決定葉片離體再生能力及再生率高低的主要因素[27]。相同處理條件下，受供體材料基因型的影響，葡萄柚愈傷組織誘導能力不同。本研究的10個葡萄柚品種葉片在相同培養條件下，“火焰”、“亨路比”、“哈路比”、“帕利斯”、“里德馬敘”、“里約紅”、“星路比”、“泰國種”8個品種均可獲得愈傷組織，但“火焰”和“亨路比”的誘導率較低，“矮化”和“瑞路比”未獲得愈傷組織。鄒美金等[28]的研究結果也發現柚類組織培養存在明顯的基因型效應。無論從愈傷組織誘導率、叢生芽分化率還是叢生芽生長情況而言，“星路比”都明顯高于其它品種如“帕利斯”和“泰國種”。這可能是源于不同基因型外植體本身內源激素的差異，不同品種間遺傳和生理上存在差異會影響細胞脫分化和再分化，導致不同基因型材料間再生表現的差異[21]。同一植物不同品種，外植體所需最佳再生培養基和植物生長調節劑水平也不盡相同。因此，在今后的實驗中將針對不同葡萄柚品種對激素種類及其濃度配比進行優化，進一步提高各個葡萄柚品種的葉片離體再生率。

本試驗對葡萄柚品種離體葉片再生體系的建立進行了初步摸索，已掌握了有效愈傷的誘導與繼代、不定芽的誘導與增殖、不定根的誘導等技術，這將為后續葡萄柚良種選育及遺傳轉化體系的建立提供良好基礎。

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