苦瓜McAGD8和小G蛋白McRABD2c基因全長cDNA的分離及序列分析

馮冬林　許端詳　高山

摘 要 構建并篩選苦瓜成熟果實cDNA文庫，分離獲得2個全長cDNA序列（命名為McRABD2c和McAGD8）。序列分析結果表明：McAGD8長度為1 695 bp，含有1個1 209 bp開放閱讀框，編碼403個氨基酸，該蛋白含有1個保守的Arf GAP結構域，與黃瓜CsAGD8-like具有90%的同源性，同甜瓜CmAGD8具有89%的同源性。McRABD2c長度為1 166 bp，含有1個609 bp開放閱讀框，推測編碼202個氨基酸，該蛋白含有Rab家族保守的RabSF（RabSF1-RabSF4）模體及特有的RabF模體（RabF1-RabF5）；5個G結構域和2個構象變構域（SwitchⅠ、SwitchⅡ）及C末端的CCX序列，同CsRABD2C-like同源性高達99%。氨基酸同源比對及進化分析結果表明McRABD2屬于小G蛋白，而McAGD8屬于Arf小G蛋白下游的效應基因。

關鍵詞 苦瓜；McRABD2c；McAGD8；序列分析

中圖分類號 Q781 文獻標識碼 A

Abstract Constructing and screening the ripe fruit cDNA library of Momordica charantia， Two full-length cDNA was isolated and designated as McAGD8 and McRABD2c separately. Sequence analysis showed that the McAGD8 is 1 695 bp in length with a complete 1 209 bp ORF and a Arf GAP domain， and encodes 403 amino acids. The comparison of deduced amino acids sequence revealed that the McAGD8 with 90% and 89% similarity respectively to the CsAGD8-like of cucumber and CmAGD8 of melon. The McRABD2c is 1 166 bp in length with a complete 609 bp ORF， and encodes 202 amino acids. McRABD2c protein included conserved RabSF（RabSF1-RabSF4）and RabF（RabF1-RabF5）motif of Rab GTPases subfamily， and five signature motif of phosphate loop（G1-G5）， two conformational switch（SwitchⅠ、SwitchⅡ）and C-terminal cysteines motif CCX. The McRABD2c showed 99% similarity with CsRABD2C-like of cucumber. Amino acids similarity and phylogenetic analysis indicated that McRABD2c is a small GTP-binding protein of Rab family， McAGD8 is a downstream effector of small GTP-binding protein Arf family.

Key words Momordica charantia； McRABD2c； McAGD8； Sequence analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2015.03.006

小G蛋白（small GTPases）是一類普遍存在于真核細胞內的單體GTP結合蛋白，屬于RAS超家族。該家族成員具有高度保守的結構及GTPases水解活性。小G蛋白家族成員眾多，根據結構和功能的相似性可以分為Ras、Rab、Rho、Arf和Ran 5個不同的亞族[1]。

Rab GTPases家族是小G蛋白家族中最大的一個成員，廣泛分布于從酵母、植物、植物及人類的真核生物中。植物Rab家族由8個亞族組成，命名為RabA、RabB、RabC、RabD、RabE、RabF、RabG、RabH。已有研究結果表明，Rab家族蛋白參與不同的運輸途徑，包括內吞作用、細胞質分裂、后高爾基體運輸到細胞質膜和液泡[2]。還參與植物生長發育過程，如胚胎發育、花粉管萌發、根毛發育等和各種脅迫應答反應[3-9]。

小G蛋白在細胞信號轉導過程中發揮“分子開關”作用，通過上游鳥苷酸交換因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）將非激活態（GDT-bound）小G蛋白激活為激活態（GTP-bound），并通過與下游效應子GAPs（GTPases activating proteins）將激活態的GTP水解為非激活態的GDP和Pi來調解小G蛋白周期循環[10]。ArfGAPs基因所含GAP結構域，應答激活Arf GTPase，其他結構域參與蛋白-蛋白互作和蛋白-油脂互作[10-11]。同時ArfGAPs具有獨立的功能，ArfGAP1能夠增強衣被蛋白的親和性，Glo3p-type ArfGAPs（Glo3p，ArfGAP2，ArfGAP3）參與動物和酵母細胞內衣被蛋白Ⅰ（COPⅠ）生物合成[12-16]。最新研究結果表明擬南芥中位于高爾基體的2個同源性較高的ArfGAP，AGD8和AGD9參與保持高爾基體形態，在植物生長發育中具有重要作用[17]。

苦瓜是一種重要的蔬菜作物，對苦瓜的一些重要調節基因的研究是有效開展苦瓜遺傳改良的重要基礎。苦瓜小G蛋白McRABD2c和小G蛋白下游效應子基因McAGD8的克隆及序列分析，對研究苦瓜McRABD2c和McAGD8基因相關功能及相關信號通路奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 植物材料

苦瓜cDNA文庫為本單位實驗室構建。苦瓜材料為福州市蔬菜科學研究所育成品種佳玉。提取苦瓜成熟果實果肉RNA，并構建cDNA文庫。

1.2 方法

基因克隆與序列分析：隨機挑取cDNA文庫陽性克隆，以M13R為測序引物，測序。將獲得的序列從GenBank（www.ncbi.nlm.gov）進行同源比對。應用DNAMAN軟件對基因序列及編碼的蛋白質進行分析；采用ExPaSy-PROSITE分析蛋白質結構域；ProtParam預測相對分子量和等電點；應用Mega6.01軟件分別分析McRABAD2C、McAGD8同擬南芥相關基因蛋白序列，并構建系統進化樹。

2 結果與分析

2.1 苦瓜McRABD2c、McAGD8基因的克隆與序列分析

本研究從苦瓜cDNA文庫中分離獲得1個苦瓜小G蛋白（Rab）和1個Arf-GTPases激活蛋白陽性克隆。經測序去除載體序列后表明cDNA長度分別為1 166 bp和1 695 bp，分別包含609 bp和1 209 bp的完整開放閱讀框，分別編碼202個和403個氨基酸的蛋白（圖1、圖2）。ProtParam預測McRABD2c分子量為22.551 5 ku，理論等電點為5.29；McAGD8分子量為43.396 2 ku，理論等電點為9.0。

2.2 蛋白序列分析

2.2.1 苦瓜McRABD2c保守結構域及系統進化分析

分析苦瓜McRABD2c氨基酸序列結果表明：該基因具有GTP/Mg2+結合位點及GDI和GEF互作位點；Rab-GTPases家族保守的RabSF模體（RabSF1-RabSF4）；Rab亞家族蛋白所特有的RabF模體（RabF1-RabF5）；參與GTP/Mg2+結合和GTP水解的G結構域（G1box-G5box）；兩個構象變構域（SwitchⅠ和SwitchⅡ）。C末端具有與異戊二烯化相關的CCX序列，有利于增強Rab蛋白的疏水性并促進C端與細胞膜相連，該序列在Rab小G蛋白調節囊泡運輸具有重要的作用（圖3）。

BLASTP序列比對結果顯示，McRABD2c與黃瓜CsRABD2C-like（XP_004148356.1）同源性高達99%，同川桑MnRABD2C（EXC02066.1）和黃瓜CsYPTM2（XP_004147230.1）具有97%的同源性，同百脈根LjRAB1C（CAA98160.1）和蘋果MdRABD2C（XP_

008369210.1）具有96%的同源性，因此推測McRABD2c為苦瓜RABD2C-like小G蛋白家族新成員（圖3）。

氨基酸序列McRABD2c與擬南芥小G蛋白家族基因經Mega6 Clustal X聚類分析后，采用Neighbor-joining進行1 000次bootstrap計算，構建系統進化樹。結果表明，McRABD2c與擬南芥小G蛋白Rab1進化距離較近（圖4）。

2.2.2 苦瓜McAGD8保守結構域及系統進化分析

氨基酸序列分析結果表明：苦瓜McAGD8含有1個Arf GAP結構域，并含有1個C4類型的鋅指結構（圖2），同時含有保守的CX2CX16CX2C結構域（圖5），該結構域能夠激活ATP 酶，調節囊泡運輸。

BLASTP結果表明，該基因序列同黃瓜CsAGD8-like（XP_004148740.1）具有高達90%的同源性，同甜瓜CmAGD8（XP_008448682.1）具有89%的同源性，同葡萄VvAGD8-like（XP_002278066.2）具有80%的同源性，同大豆GmAGD8-like（XP_003531961.1）具有78%的同源性，同梅子PmAGD8（XP_008238246.1）具有77%的同源性。表明苦瓜McAGD8為苦瓜AGD8-like蛋白家族新成員（圖5）。

McAGD8與擬南芥AGD蛋白家族基因經Mega6 Clustal X聚類分析后，采用Neighbor-joining進行1 000次bootstrap計算，構建系統進化樹。結果表明，McAGD8與擬南芥AtAGD8蛋白進化距離較近（圖6）。

3 討論與結論

迄今為止在擬南芥中發現的93個小G蛋白中共有57個Rab GTPases[18-19]，是小G蛋白超家族中最大的家族，主要參與囊泡運輸、調節蛋白質分泌、細胞信號調控等[20]。含有4個Rab1蛋白（AtRABD2a、AtRABD2b、AtRABD2c、AtRABD1）。同哺乳動物中的Rab1和酵母中的Ypt1具有高度的同源性。已有研究結果表明，動物中Rab1位于內質網及高爾基體的中間艙及高爾基體，調節內質網到高爾基體間的跨膜運輸[21-22]；酵母中的YPT1對內質網到高爾基體間的跨膜運輸起重要作用[23]；擬南芥中AtRABD2a的顯性失活突變體瞬間表達能夠將熒光富集在內質網上[24]；擬南芥AtRABD2b同植物生長發育相關，參與花期、衰老及脅迫調節，并參與ABA途徑[25]。

本研究中McRABD2c是從苦瓜成熟果實中獲得的，是否表明該基因參與了果實成熟過程的調控，與乙烯誘導途徑是否相關，是否參與了植物衰老過程及是否與逆境脅迫相關等還有待于進一步研究確認。

所有小G蛋白包括ArfGTPases從激活態（GTP-bound）到非激活態（GDT-bound）之間的循環過程需要下游效應子的調節。調節ArfGTPases的效應子即是ArfGAPs（AGD）。擬南芥含有15個AtAGDs，共分為4組，具有跨膜運輸的功能。AGD8為第二組成員，含有1個Arf GAP結構域，并含有1個C4類型的鋅指結構，同時含有保守的CX2CX16CX2C結構域[19]。已有研究結果表明該基因位于高爾基體[26-27]，功能作用到目前為止還不清楚。本研究克隆并分析McAGD8基因生物信息，為進一步分析基因功能，并進一步揭示該基因調控細胞生命活動的分子機制提供一定的研究基礎。

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