貴陽地區(qū)224 例哮喘兒童IL-17A-152G/A 位點基因多態(tài)性及與哮喘易感性的研究*

曾 艷，李 波，楊 俊，夏夢青，朱曉萍＊＊

(1.貴州醫(yī)科大學 兒科學教研室，貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學附院 兒科，貴州 貴陽 550004)

支氣管哮喘(簡稱哮喘)在兒童中的患病率呈逐年上升趨勢［1］，該病是一種慢性氣道炎癥性疾病，由多種細胞及細胞因子參與，以氣道炎癥和氣道重塑為主要病理特征，慢性炎癥與氣道高反應性相關(guān)，氣道高反應性可導致反復喘息發(fā)作、呼吸困難、胸悶和咳嗽(尤其是在夜間和凌晨)。白細胞介素-17(IL-17)是一種前炎性細胞因子，是T 淋巴細胞誘導的炎性反應的早期啟動因素，能誘導和激活中性粒細胞在呼吸道的募集，為明確IL-17 基因與貴陽地區(qū)兒童哮喘的相關(guān)性，本研究采用病例對照的方法、PCR-RFLP 技術(shù)檢測技術(shù)，探討IL-17A基因-152G/A 位點的多態(tài)性及其與貴陽地區(qū)兒童哮喘發(fā)病的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 研究對象與分組

哮喘組為2012 年11 月～2015 年1 月確診支氣管哮喘的患兒224 例，符合兒童支氣管哮喘診斷與防治指南診斷標準［2］，男152 例，女72 例，平均(6.11±3.27)歲。對照組為同期門診健康體檢兒童150 例，男93 例，女57 例，平均(5.61±3.55)歲，對照組兒童均排除哮喘病史、家族哮喘、過敏性疾病史和其他過敏性疾病史。兩組兒童均在貴陽居住半年以上，采血前4 周內(nèi)未靜脈使用糖皮質(zhì)激素，且均無血緣關(guān)系。

1.2 主要儀器及試劑

Eppendorf 聚合酶鏈反應(PCR)儀(德國艾本德公司)，BeckmanDU640 型核酸蛋白分析儀(Beckman 公司)，G:BOX 凝膠成像系統(tǒng)(基因有限公司)，DNA 提取試劑盒和2×Taq PCR MasterMix［天根生化科技(北京)有限公司］，引物合成(北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司)，PdmⅠ內(nèi)切酶(賽默飛世爾科技)，500 bp DNAMarker［寶生物工程(大連)有限公司］。

1.3 方法

1.3.1 全血DNA 提取 取空腹靜脈血3 mL，4 ℃靜置2 h，血凝塊用DNA 提取試劑盒(離心柱型，DP335)提取全血DNA。

1.3.2 引物設計 參照GeneBank 中人IL-17A DNA 序列編號(NC_000006.12)，根據(jù)rs2275913在美國國立生物技術(shù)信息中心網(wǎng)站上查詢-152G/A 位點的基因序列，參考文獻［3－4］確定突變位點，用Primer Premier5.0 軟件設計引物。

1.3.3 IL-17A 基因-152G/A 位點PCR-RFLP 檢測

上游引物序列為5'-CAG AAG ACC TAC ATG TTA CT-3'，下游引物序列為5'-GTA GCG CTA TCG TCT CTC T-3'。PCR 目的片段擴增PCR 反應體系:25 μL 反應體系含2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，10 μmol/L 上、下游引物各0.8 μL，50 mg/L DNA模板2 μL，ddH2O 8.9 μL。PCR 反應條件94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s，59 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，共30 次循環(huán)，72 ℃最后一次延伸5 min，反應產(chǎn)物用2%瓊脂糖凝膠水平電泳判斷是否擴增成功。擴增產(chǎn)物的限制性片段長度多態(tài)性分析:15 μL酶切體系含PCR 產(chǎn)物5 μL，10×FastDigest Green Buffer 1 μL，限制性內(nèi)切酶PdmⅠ(FastDigest PdmⅠ)0.5 μL，ddH2O 8.5 μL，置于37 ℃恒溫水浴箱反應5 min，轉(zhuǎn)至65 ℃恒溫水浴箱5 min 使酶失活，酶切結(jié)果用2%瓊脂糖凝膠水平電泳后采用G:BOX 凝膠成像系統(tǒng)鑒定。

1.4 統(tǒng)計學方法

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0 統(tǒng)計軟件進行分析，樣本分布經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢驗，檢驗樣本群體代表性;計數(shù)資料用百分比表示，病例組和對照組的基因型及等位基因頻率分布的差異用χ2檢驗分析，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 IL-17A 基因-152G/A 位點

PCR 擴增產(chǎn)物結(jié)果顯示哮喘組和對照組均擴增出344 bp 目的片段，見圖1。哮喘組和對照組PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)PdmⅠ酶切后均發(fā)現(xiàn)AA、AG、GG3 種基因型，AA 基因型為213 bp、131 bp，AG 基因型為344 bp、213 bp、131 bp，GG 基因型為344 bp。見圖2。

圖1 哮喘組和對照組IL-17A-152G/A位點PCR 擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of PCR products of the-152G/A site of IL-17A gene

圖2 IL-17A 基因-152G/A 位點不同基因型PCR 產(chǎn)物酶切電泳結(jié)果Fig.2 Enzyme digestion electrophoresis of PCR products of different genotypes of IL-17A gene-152G/A site

2.2 IL-17A 基因-152G/A 位點基因型及等位基因頻率分布

哮喘組和對照組經(jīng)Hardy-Weinberg 平衡檢測示均具有群體代表性(表1)，在性別、年齡上差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=1.364，t =1.388，P ＞0.05)。兩組間基因型頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=7.832，P =0.020)，經(jīng)χ2分割檢驗，AA 基因型與AG 基因型頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.395，P=0.036，OR=1.929，95%CI=1.038 ～3.588)，AA 基因型與GG 基因型頻率分布差異亦有統(tǒng)計學意義(χ2=7.826，P=0.005，OR=2.571，95%CI=1.315 ～5.029)，AG 基因型與GG基因型頻率分布差異無統(tǒng)計學意義(χ2=1.426，P=0.232);兩組間等位基因頻率分布差異有統(tǒng)計學意義(χ2=6.635，P =0.01，OR=1.477，95%CI=1.097 ～1.988);變異等位基因A 與哮喘關(guān)聯(lián)，A 基因攜帶者患哮喘的風險高于非攜帶者，尤以突變純合子AA 為著。見表1。

表1 哮喘組和對照組被檢兒童IL-17A 基因-152G/A 位點基因型及等位基因分布Tab.1 Characteristics of the genotype and allele frequencies of IL-17A gene-152G/A site of children in asthma group and control group

3 討論

Th17 細胞是Park 于2005 年在對兩種自身免疫疾病動物模型，實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)、膠原誘導性關(guān)節(jié)炎(CIA)的研究過程中發(fā)現(xiàn)的一類不同于Th1 和Th2 的CD4+Th 亞群細胞［5］，可以誘導組織發(fā)生強烈炎癥反應的T 細胞亞群［6］，可以通過多種途徑參與哮喘的發(fā)生發(fā)展，其效應因子IL-17 與哮喘等疾病明顯相關(guān)［7］。IL-17 通過促進樹突狀細胞的成熟，刺激相關(guān)細胞產(chǎn)生一系列炎性介質(zhì)和趨化細胞因子等，導致炎癥反應的發(fā)生［8］，活化的IL-17 還可激活上皮細胞、成纖維細胞和巨噬細胞，釋放粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)、IL-1、IL-6 和IL-8 等，不僅促進氣道炎癥的進一步加劇，還能參與氣道的重構(gòu)。氣道重塑病理基礎包括氣道上皮細胞和平滑肌增生，粘液高度分泌，上皮下組織纖維化，以及血管生成［9］。

研究表明，IL-17A 基因的單核苷酸多態(tài)性與多種疾病相關(guān)，尤其是自身免疫性疾病［10］。一項日本研究報道，rs2275913 位點(-152G/A)位于IL-17A 啟動子區(qū)域，可調(diào)控IL-17 表達，A 等位基因可增強啟動子活性并增強啟動子與核轉(zhuǎn)錄因子活化T 淋巴細胞核因子的結(jié)合能力，促進IL-17 表達［11］。基因內(nèi)部的單核苷酸多態(tài)性直接或間接影響蛋白質(zhì)表達水平或性質(zhì)，從而導致遺傳易感性。

Nordang 等［12］對挪威和新西蘭的高加索人進行研究，發(fā)現(xiàn)在IL-17A 的5 個SNP 多態(tài)性基因位點中rs2275913 與挪威人類風濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生有關(guān)，而與新西蘭的高加索人類風濕性關(guān)節(jié)炎卻沒有明顯相關(guān)性。Arisawa 等［13］對日本UC 患者IL-17A/F 基因多態(tài)性的分析中認為，rs2275913 和rs763780 的基因多態(tài)性均與UC 的患病相關(guān)。

本研究結(jié)果示哮喘組及對照組均存在野生型(GG)、雜合子型(AG)及突變型(AA)三種基因型，基因型及等位基因頻率在兩組間差異均有統(tǒng)計學意義，發(fā)現(xiàn)IL-17A 基因-152G/A 位點多態(tài)性與貴陽地區(qū)兒童哮喘發(fā)病存在相關(guān)性，A 等位基因頻率顯著高于對照組，可能增加兒童患哮喘的風險，當G 突變?yōu)锳 時，患哮喘的風險是健康兒童的1.477倍，尤其以突變純合子AA 基因型較其他基因型更易患哮喘，為其它基因型的2.134 倍(χ2=6.376，P =0.012，OR=2.134，95%CI=1.174 ～3.877);Chen J 等［3］對IL-17A rs2275913 位點基因型頻率檢測中發(fā)現(xiàn)該位點和哮喘相關(guān)，純合子A 的兒童患哮喘的幾率是其他基因型的2.29 倍，這與本實驗結(jié)果一致。但Wang 等［14］對臺灣地區(qū)漢族哮喘兒童IL-17A 基因多個多態(tài)性位點的研究中發(fā)現(xiàn)－152A/G 位點與該地區(qū)哮喘發(fā)病無關(guān);王娟等［15］研究發(fā)現(xiàn)IL-17A 基因rs711998 可能是兒童哮喘易感位點，其中該位點GG 純合子基因型與哮喘發(fā)病密切相關(guān)，未發(fā)現(xiàn)IL-17A rs2275913 多態(tài)性與哮喘發(fā)病有相關(guān)性，這與本實驗結(jié)果不同。哮喘是一種復雜的多基因遺傳傾向的疾病，人體中基因與基因之間有著相互作用及累積效應，環(huán)境因素，在兒童中如被動吸煙、空氣中的塵螨、寵物毛屑等均可影響哮喘的易感性，這些均可造成實驗結(jié)果的差異。

綜上所訴，IL-17A 基因-152G/A 位點可能是貴陽地區(qū)兒童哮喘的候選基因，目前指南推薦的吸入性激素(ICS)治療雖能有效控制嗜酸性粒細胞介導的氣道炎癥，但對中性粒細胞炎癥及氣道重塑無效，IL-17 作為促進哮喘中性粒細胞炎癥的重要因子，與哮喘氣道重塑關(guān)系密切，有望成為防治哮喘的新靶點。進行哮喘易感基因的多態(tài)性的檢測，希望能早期從基因水平篩選哮喘易感人群，以便早期診斷、干預及治療。

［1］全國兒科哮喘協(xié)作組.第三次中國城市兒童哮喘流行病學調(diào)查［J］.中華兒科雜志，2013(10):729－735.

［2］中華醫(yī)學會兒科學會呼吸學組.《中華兒科雜志》編輯委員會.兒童支氣管哮喘診斷與防治指南.中華兒科雜志，2008(10):745－753.

［3］Chen JH，Deng Y，Zhao J，et al.The Polymorphism of IL-17 G-152A was Associatedwith Childhood Asthma and Bacterial Colonizationof the Hypopharynx in Bronchiolitis［J］.J Clin Immunol，2010(4):539－545.

［4］Kaabachi W，Amor AB，Kaabachi S，et al.Interleukin-17A and-17F genes polymorphisms in lung cancer［J］.Cytokine，2014(1):23－29.

［5］Park H，Li Z，Yang XO，et al.A distinct lineage of CD4 T cells regulates tissue inflammation by producing interleukin 17［J］.Nat Immunol，2005(11):1133－1141.

［6］Lan F，Liu K，Zhang J，et al.Th17 respones is augmented in OVA-induced asthmatic mice exposed to HDM［J］.Med Sci Monit，2011(5):132－138.

［7］Pene J，Chevalier S，Preisser L，et al.Chronically inflamed human tissues are infiltrated by highly differentiated Th17 lymphocytes［J］.J Immunol，2008(11):7423－7430.

［8］Besnard AG，Togbe D，Guillou N，et al.IL-33-activated dendritic cells are critical for allergic airway inflammation［J］.Eur J Immunol，2011(6):1675－1686.

［9］Gras D，Bourdin A，Chanez P，et al.Airway remodeling in asthma:clinical and functional correlates［J］.Med Sci(Paris)，2011(11):959－965.

［10］zhu S，Qian Y.IL-17/IL-17receptor system in autoimmune disease:mechanisms and therapeutic potential［J］.Clin Sci(lOND)，2012(11):487－511.

［11］Espinoza JL，Takami A，Nakata K，et al.A genetic variant in the IL-17 promoter is functionally associated with actue graft-versus-host disease after unrelated bone marrow transplantation［J］.PLoS One，2011(10):26229.

［12］Nordang GB，Viken MK，Hollis-Moffatt JE，et al.Association analysis of the interleukin 17A gene in Caucasian rheumatoid arthritis patients from Norway and New Zealand［J］.Rheumatology(Oxford)，2009(4):367－370.

［13］Arisawa T，Tahare T，Shibata T，et al.The influenceof polymorphisms of interleukin-17A and interleukin-17F genes on the susceptibility to ulcerative colitis［J］.J Clin Immunol，2008(1):44－49.

［14］Wang JY，Shyur SD，Wang WH，et al.The polymorphisms of interleukin 17A(IL 17A)gene and tis association with pediatric asthma in Taiwanese population［J］.Allergy，2009(7):1056－1060.

［15］王娟，周娟，藺麗慧，等.IL-17 基因啟動子區(qū)單核苷酸多態(tài)性與兒童哮喘的關(guān)系［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2011(5):481－484.