電灸心力衰竭大鼠內關—間使穴對心功能和內源性H2S的影響

崔白蘋?丁鳳云

摘 要：目的：研究電灸（electroacupuncture， EA）慢性心力衰竭（chronic heart failure， CHF）大鼠內關-間使穴對CHF大鼠心功能和內源性H2S的影響。方法：SD大鼠隨機分為假手術組、結扎左前降支冠狀動脈致CHF組。CHF大鼠隨機分為EA組和對照組。EA組每天電灸刺激內關-間使穴30min，EA對照組每天電灸刺激內關穴旁偏歷-溫溜穴（大腸經），超聲心動圖測定CHF大鼠心功能、心臟重塑和心肌梗死面積，取心臟和血酶聯免疫吸附（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）測定H2S含量。結果：與CHF大鼠和EA對照組相比，EA顯著升高CHF大鼠左心室射血分數、逆轉擴大的左心室收縮末期直徑和舒張末期直徑，降低梗死面積。EA組CHF大鼠心肌和血中H2S測定值顯著高于對照EA組（心肌（10.13+3.35umol/L） vs （22.26+2.97umol/L）；血漿 （33.34+3.25umol/L） vs （51.13+2.55 umol/L） ， P < 0. 001），差異有顯著性（ P 均< 0. 001）。結論：EA對CHF大鼠心肌有保護作用，能逆轉心室重構，EA升高CHF大鼠心肌和血中H2S。EA可能是通過升高內源性H2S改善CHF大鼠心功能。EA可以作為一種治療CHF的有效替代療法。

關鍵詞：電灸；心力衰竭；H2S ；內關-間使穴

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）是指由于心肌收縮力下降，使心輸出量不能滿足機體代謝的需要而引起的以循環功能障礙為主的綜合征。隨著人口老齡化進程的加快和高血壓病、冠心病等常見心血管病發病率的上升，CHF患病率正逐漸升高。據世界衛生組織（WHO）預測，到2020年心血管疾病將成為世界上死亡率最高的疾病。心力衰竭是多種心血管疾病的最終結局，心室重構被認為是導致心力衰竭及其病情惡化的內在原因。中醫理論中，針灸早在1000多年前就已經用來治療多種疾病和不適，現在世界范圍內已經廣泛接受針灸作為一種替代療法。臨床證據和動物實驗均表明針灸對高血壓、心律失常和冠心病[1-4]都有治療作用。內關屬手厥陰心包經，間使屬手厥陰心包經，位于正中神經上[5-6]。刺激內關-間使穴能顯著降低心交感神經反射[1，4，7]。因此，本實驗選內關-間使穴施行電灸。硫化氫（hydrogen sulfide， H2S）是繼一氧化氮（nitric oxide， NO）和一氧化碳（carbonic oxide， CO）之后發現的第三類氣體信號分子，具有多種生理功能。心臟病內源性H2S降低[8-11]；H2S可以抑制心肌重構[9，12-14]；H2S通過抗氧化、抗凋亡保護心肌細胞。電灸CHF大鼠內關-間使穴對CHF大鼠心臟是否有保護作用，對內源性H2S是否有影響尚不清楚。

一、材料與方法

1.材料

（1）實驗動物。雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，清潔級，體重300～400g，由南京醫科大學實驗動物中心提供。實驗動物使用遵守美國國家衛生機構發布的《實驗動物保護和使用指南》（NIH，Publication No.85-23，1996修訂版）。大鼠隨機分為兩組，一組為慢性心力衰竭模型（CHF）組，另一組為假手術（Sham）組。實驗大鼠在溫度22 ℃、濕度30～40%的環境中飼養，12小時明暗周期，自由飲水和攝食。

（2）試劑與儀器。主要試劑：戊巴比妥鈉（生工生物工程（上海）股份有限公司），H2S ELISA試劑盒（Rapidbio，West Hills，USA）。主要儀器：Vevo超高分辨率小動物超聲影像系統（Vevo2100， 加拿大VisualSonics公司）；PowerLab數據分析處理系統（8SP，AD instruments，澳大利亞）；小動物呼吸機（Model 683，Harvard Apparatus Inc.，美國）；臺式高速冷凍離心機（Sigma，1-15PK，德國）；HANS-200A韓氏穴位神經刺激儀（北京盛達醫療器械中心， 北京）。

2. 實驗方法

（1）動物造模。本實驗采用冠狀動脈結扎誘發CHF方法。在戊巴比妥鈉（50 mg/kg，i.p.）麻醉下，按照無菌操作進行手術。經口腔途徑氣管插管，與嚙齒類動物呼吸機（Model 683，Harvard Apparatus Inc.，USA）相連進行機械通氣。在無菌手術條件下于左側第四肋間隙打開胸腔，剪開心包，暴露心臟。用6/0號縫合線在靠近主動脈根處結扎冠狀動脈左前降支（left anterior descending coronary artery，LAD），引起心臟局部缺血。Sham組除了不結扎LAD外，其余操作均相同。大鼠死亡率約30%，死亡主要發生在結扎后第一天。EA實驗在冠狀動脈結扎或對照組假手術后4周末進行。用Vevo超高分辨率小動物超聲影像系統（Vevo2100， 加拿大VisualSonics公司）評價心率、射血分數（ejection fraction，EF）、短軸縮短率（shortening fraction，FS）、左室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic dimension，LVEDD）和左室收縮末期內徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD） 指標確定CHF成模。

（2）電灸內關-間使穴。大鼠的穴位與人類似，內關-間使穴位于中神經上。不繡鋼電針置于腕關節上1.5-2.0mm和2.5-3.0mm處掌長肌腱和屈腕橈側的韌帶中間的內關間使穴上。穴位準確的標準是電針刺激時大鼠前爪輕幅度震動。HANS-200A韓氏穴位神經刺激儀低電流、低頻（2Hz，2mA）刺激30min。CHF大鼠EA對照組選擇了靠近內關-間使穴的偏歷-溫溜穴（大腸經）。

（3） H2S 的ELISA檢測。采取大鼠腹主動脈血2 ml， 3000 r/ min 離心10 min， 分離血漿， EP 管密封后- 70 ℃ 保存待檢， 測定前將標本復融， 3000 r / min 離心10 min， 取上清液檢測。心肌組織冰上充分碾磨勻漿，離心20min（3000r/min），收集上清- 70 ℃ 保存待檢。應用酶聯免疫吸附測定法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），按照大鼠ELISA試劑盒（ Rapidbio （RB）， West Hills， CA， USA）說明書中所述操作步驟分別檢測血漿和心肌組織中H2S水平。簡述如下：在酶標板上加樣、溫育、配液、洗滌、加酶、溫育、洗滌、顯色、加終止液、在酶標儀（ELX-800，BioTeK，Winooski，USA）上讀取樣本吸光度，繪制標準曲線，并根據標準曲線方程和標準品濃度，計算H2S水平。

（4）計算梗死面積。以常規的方式處理進行組織學研究，從頂點到底部把左心室切成四橫片，5um厚，Masson染色。ImageJ 1.34軟件是用來測量長度和左心室梗死面積。在每個心肌組織片，梗死率定義為梗死部位周長與整個心內膜的周長的比值。左心室切片的面積乘以梗死率就是該心肌切片的梗死面積。左心室的梗死率就是左心室的梗死面積與左心室總面積的比值 。

（5）統計處理方法。應用SPSS 17. 0 統計軟件對數據進行分析。計量資料以均數+標準差（ x + SE） 表示， 兩組間比較用t 檢驗， 多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 法。計數資料組間比較用卡方檢驗。應用Pearson 法進行相關性分析。以P < 0.05 為差異有統計學意義。

二、 結果

1. 解剖學和血流動力學變化

CHF大鼠左心室梗死面積平均為左心室面積的34.5%，而Sham組大鼠沒有明顯的心肌梗死。與Sham大鼠相比，CHF大鼠心臟的重量與體重比值顯著增加，這提示CHF大鼠心肌非梗死區發生肥大。CHF大鼠射血分數、左室短軸縮短率和+LV dP/dtmax降低，而LVESD和LVEDD增加，這提示CHF大鼠心臟射血功能降低，心室擴張重構（Table 1）。

三、討論

心臟的收縮和舒張功能受損形成CHF。目前，CHF的主要病因是缺血性心臟病、高血壓和心肌病。盡管心衰藥物的療效越來越好，世界范圍內，CHF仍有較高的發病率和死亡率，據報道，男性患者5年存活率25%，女性患者5年存活率38%，因此，發現有效的治療心衰的方法備受期待。針灸是被普遍接受的治療干預手段，在美國針灸是廣泛應用的替代療法。針灸除了治療術后疼痛，還可以有效地治療術后和化療引起的惡心和嘔吐。針灸也可以作為一個有效的方法治療其他情況，如上癮、頭痛、網球肘、肌筋膜疼痛、年骨關節炎、腰痛和哮喘。內關-間使穴是治療心血管疾病最有效的穴位[23- 25]。在冠狀動脈部分阻塞的貓身上，模擬EA內關穴刺激中神經能增加心臟供氧，減少局部心肌梗死面積。硫化氫（H2S）是人體內繼一氧化碳（CO）、一氧化氮（NO）后的第3種氣體信號分子，在中樞、心血管系統等發揮重要作用。先天性心臟病患兒和心力衰竭病人血漿H2S降低[27，28]，大量研究證明，H2S可抑制心力衰竭的發生，對心臟具有保護作用[29-31]。H2S可以改善心肌重構， 缺血誘發心衰的小鼠模型中，再灌注后連續給予7 天 H2S 供體Na2S 可有效抑制心衰導致的左心室舒張末期及收縮末期容積增加，并抑制左室射血分數、左室縮短率的降低，提高左心室功能，發揮心臟保護作用。但是， EA是否能增加內源性H2S，能否能改善心功能和心室重構尚不清楚。

我們實驗證明，EA能改善心功能，降低心肌梗死面積，改善心肌重構；EA能升高CHF內源性H2S。EA升高CHF內源性H2S可能是改善心功能和重構的重要機制。EA能降低CHF大鼠的血壓和心率，但是與對照-EA相比沒有顯著差異。有研究證明低頻刺激人的內關-間使穴對血壓和心率有雙向調節作用。研究發現針灸可以通過降低交感神經的興奮性，改善心功能，但其具體的分子機制尚不清楚。

針灸可以作為一種有效的治療心衰的替代療法，其大規模、長期的臨床試驗和其作用機制有待進一步開展實施。

參考文獻：

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基金資助：江蘇高校優勢學科建設工程資助項目（JX10231801）.