Hedgehog信號通路分子在食道鱗狀細胞癌中的表達及臨床意義*

崔宏偉 師迎旭 張滿 楊凌

我國食道鱗狀細胞癌的發病率占全世界總和的70%，在我國因腫瘤死亡的疾病中排名第四。食道癌在組織學上有兩種主要的類型：鱗狀細胞癌（ESCC）和腺癌（EAC）型，其在不同的地區有不同的發病率且在世界范圍內食道鱗狀細胞癌是主要的食道癌類型。由于早期診斷方法有限，食道鱗狀細胞癌發現較晚，導致其預后很差，5年生存期在10%~25%[1]。因此，細致地研究食道鱗狀細胞癌的分子機理，可為開發新的治療靶點提供依據。作為一個重要的發育相關信號通路，hedgehog信號通路對維持組織極性和干細胞群體起到重要作用。Hh通路組分也在多種上皮腫瘤中持續有活性，包括小細胞肺癌、胰腺癌，其他胃腸道腫瘤和前列腺癌[2-8]。為了更好的闡明hedgehog信號激活在食道癌發生和發展過程的作用，筆者檢測了hedgehog靶基因和通路信號分子在食道鱗狀細胞癌中的表達。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究選取內蒙古醫科大學附屬醫院胸外科2013年3月-2014年5月經手術切除、病理科確診為食道鱗狀細胞癌的標本共12例，其中男9例，女3例，年齡36~78歲，平均（53.61±10.63）歲，所有患者于術前均未行放化療治療。病理類型均為鱗狀細胞癌，其中Ⅱ級8例，Ⅲ級4例。另選擇距腫瘤邊緣2 cm處經病理證實為正常組織的食道黏膜作為對照，全部實驗標本均經4%多聚甲醛固定、石蠟包埋，切厚度為5 μm片，烤片備用。

1.2 主要試劑 堿性磷酸酶標記的地高辛抗體、底物BCIP/NBT購于Roche公司，蛋白激酶K購于Promega公司，探針購于愛科博生物公司，無水乙醇、二甲苯等試劑均為分析純。

1.3 原位雜交方法檢測 將事先粘片備好的石蠟切片脫蠟經梯度二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水處理，置于蛋白激酶K中，37 ℃水浴箱消化15 min，PBS清洗2次（每次5 min）。4%多聚甲醛固定，PBS清洗2次（每次5 min）。在預雜交液中，37 ℃孵育2 h。切片滴加探針，蓋上蓋玻片置于42 ℃水浴箱中雜交過夜。滴加堿性磷酸酶標記的地高辛抗體（Dig-AKP），室溫放置30 min，專用洗液洗2次（每次5 min），加BCIP/NBT于暗處顯色，顯微鏡下觀察染色程度，終止顯色，常規脫水，透明封片。結果判定：以細胞核或/和細胞漿呈藍色、藍紫色、紫色顆粒為陽性表達。每張切片中任取5個具有代表性的400倍光鏡視野，取其平均值。

1.4 統計學處理 使用SPSS 13.0統計學軟件進行分析，計量資料采用（±s）表示，計數資料采用 字2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

筆者發現在12例食道癌中10例（83%）分別表 達 Gli1、Hip或 是 PDGFRα 基 因，Gli1、Hip和PDGFRα的轉錄只在組織的癌細胞中檢測到，而在其周圍的間質組織中未發現，見圖1。進一步分析發現在10例食道癌組織中Gli1、Hip和PDGFRα出現共表達，在對照組中均未表達，兩組比較差異均有統計學意義（P<0.05），說明在食道癌中PDGFRα和Hip與PTCH1或是Gli1一樣可以用來作為hedgehog通路激活的分子標記。筆者還對這三種基因的表達與患者的臨床資料進行了分析，發現其與患者的性別、年齡，食道鱗狀細胞癌的腫瘤分化、分期無相關性（P>0.05），見表1。12例癌旁組織中未發現三個通路靶基因的表達。

除了hedgehog通路靶基因，筆者還檢測了Smo和Su（Fu）在食道癌中的表達。Smo和Su（Fu）的轉錄子的陽性表達率為83%（10/12）和67%（8/12），Smo和Su（Fu）的轉錄只在組織的癌細胞中檢測到，而在其周圍的間質組織中未發現，見圖1。在食道癌中Smo、Gli1、Hip和PDGFRα的轉錄子高度共同表達，在對照組中均未表達，兩組比較差異均有統計學意義（P<0.05）；Smo、Gli1、Hip和PDGFRα共同表達的組織中，有2例沒有發現Su（Fu）的表達，暗示在2個組織中Su（Fu）的沉默可能是hedgehog通路異常激活的原因。筆者還對這2個基因的表達與患者的臨床資料進行了分析，發現其與患者的性別、年齡，食道鱗狀細胞癌的腫瘤分化、分期無相關性（P>0.05），見表1。12例癌旁組織中未發現兩個通路分子的表達。

表1 hedgehog信號通路分子Gli1、Hip、PDGFRα、Smo及Su（Fu）基因在食道鱗狀細胞癌組織中表達 %

圖1 Hedgehog通路分子基因在食道鱗狀細胞癌組織中的表達（×200）

3 討論

Hedgehog信號通路的主要傳導機制從果蠅到人類是相對保守的，七次跨膜蛋白smoothened（SMO）是該途徑的信號轉導的關鍵分子，另一個跨膜蛋白Patched （PTCH）在沒有Hedgehog配體的情況下會抑制SMO的功能。在有Hedgehog配體的情況下，Hedgehog和它的受體PTCH結合，釋放PTCH對SMO的抑制，SMO傳導信號最終到Gli轉錄因子。作為轉錄因子，Gli通過與靶基因的起始區特異序列直接結合來調控其表達。有實驗報道在幾種食道癌細胞系和食道癌標本中發現Sonic hedgehog（SHH）和信號通路靶基因的表達增加[8-10]。Gli的表達與腫瘤浸潤的深度，淋巴結轉移和預后差相關[9]。研究還表明進行放化療的患者Gli在細胞核表達要比Gli在細胞質表達的患者的預后差[11]。

為了更好地了解食道鱗狀細胞癌中hedgehog通路的情況，筆者檢測了Gli1、Hip、PDGFRα、Smo、Su（Fu）基因的表達。有研究表明，在C3H10T1/2細胞中，Gli1可以調控PDGFRα的表達[12]。筆者的實驗結果顯示PDGFRα與靶基因Gli1的表達一致，說明在腫瘤組織中PDGFRα的表達可能受到Gli1基因的調控。目前STI571作為PDGFRα的抑制劑應用在臨床治療中，食道鱗狀細胞癌中高表達PDGFRα的患者，也可以考慮接受STI571的治療[13]。HIP作為已知的hedgehog通路靶基因，能夠與受體PTCH競爭與Hh蛋白的結合，同時，它也是該信號通路的負調節子，形成負反饋途徑。胃癌、食道癌和直腸癌中HIP啟動子的過甲基化導致HIP的表達下降[14]。而筆者的研究結果顯示Hip和Gli1基因表達一致，未發現Hip基因沉默。Su（Fu）是hedgehog通路中的抑制因子，可以通過抑制Gli分子的活性來抑制hedgehog通路的激活，在肺癌細胞中研究發現由于過甲基化而導致Su（Fu）基因的沉默[15-16]。筆者的研究結果未發現Su（Fu）基因表達的明顯的改變，只有2例癌組織在其他通路組分表達的情況下Su（Fu）基因的表達缺失。SMO是hedgehog通路中重要的信號傳導分子，SMO基因的突變在皮膚基底癌中導致hedgehog通路的激活，在部分膀胱癌中也有SMO基因表達升高的報道，筆者的研究結果發現SMO基因表達也升高且和Gli1、Hip表達一致[17]。

hedgehog通路中很多變化均可導致信號通路的激活，其可能的機制有hedgehog蛋白的表達升高，信號通路負調節子的過甲基化（如HIP，Su（Fu）），信號通路下游分子基因的擴增（如Gli轉錄因子）。基于這些發現，筆者可以預測對于hedgehog通路激活的食道癌的治療策略要具體情況具體對待。例如，對于過表達hedgehog蛋白而引發hedgehog通路激活的腫瘤可以用hedgehog中和抗體或是SMO拮抗劑來治療；對于Gli1或是Su（Fu）分子變化而引發的腫瘤可以用Gli1的抑制劑來治療；而對于hedgehog通路沒有激活的腫瘤用hedgehog通路抑制劑來治療可能沒有任何作用。

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