納米復(fù)合材料標(biāo)記物放大電化學(xué)免疫分析乳制品中的大腸桿菌

張新愛 鄭光榮 申建忠 韓恩 董曉婭

摘要：將檢測抗體（dAb和二茂鐵甲酸（FCA固載于二氧化硅修飾的氧化鋅（nO@SiO2表面制備納米復(fù)合材料標(biāo)記物（{dAb-nO-FCA}，并將其用于放大電化學(xué)免疫分析乳制品中大腸桿菌（Escherichia coli。采用“三明治”免疫分析模式，基于二茂鐵甲酸產(chǎn)生的電流信號(hào)與大腸桿菌濃度之間的關(guān)系實(shí)現(xiàn)了對大腸桿菌的檢測。結(jié)果表明，二茂鐵甲酸產(chǎn)生的電流信號(hào)與大腸桿菌濃度的對數(shù)在20×102 ～ 20×106 CFU/mL范圍內(nèi)保持良好的線性關(guān)系，檢出限為100 CFU/mL（S/N=3。利用該電化學(xué)免疫分析方法對乳制品進(jìn)行了大腸桿菌的加標(biāo)回收試驗(yàn)，回收率在958%～105%之間。

關(guān)鍵詞：納米復(fù)合材料標(biāo)記物；放大電化學(xué)免疫分析；乳制品；大腸桿菌

中圖分類號(hào)： TS2074文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（201412-0342-02[HS][HT9SS]

收稿日期：2014-07-14

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（ 編號(hào)：21205051；中國博士后科學(xué)基金（ 編號(hào)：2013M541605；江蘇大學(xué)高級(jí)專業(yè)人才科研啟動(dòng)基金（編號(hào)：11JDG144。

作者簡介：張新愛（1982—，女，博士，講師，從事食品質(zhì)量與安全研究。 E-mail：zhangxinai@mailujseducn。

乳制品含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，在生產(chǎn)、加工、運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中極易受到致病性細(xì)菌的污染，從而會(huì)影響人們的生活質(zhì)量和健康水平[1]。人類通過乳源性途徑引起的食物中毒與乳制品中大腸桿菌（Escherichia coli的數(shù)量呈現(xiàn)一定的相關(guān)性，因此，大腸桿菌已經(jīng)成為評價(jià)乳制品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，被世界各國乳制品微生物標(biāo)準(zhǔn)列為必檢項(xiàng)目。目前，大腸桿菌常用的檢測方法，由于耗時(shí)長在一定程度上已經(jīng)不能滿足快速檢測的需求。因此，建立乳制品中大腸桿菌的快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測方法顯得尤為重要。

免疫檢測技術(shù)由于具有選擇性好、抗干擾能力強(qiáng)的特點(diǎn)而得到了人們的普遍關(guān)注[3-5]。其中，電化學(xué)免疫分析法具有簡單快速、選擇性好、易于小型化等優(yōu)點(diǎn)[6]。實(shí)現(xiàn)信號(hào)放大從而提高檢測靈敏度是制約電化學(xué)免疫分析方法快速發(fā)展的關(guān)鍵問題[7]。納米材料的應(yīng)用為發(fā)展新型靈敏的電化學(xué)免疫分析體系打開了一片新天地[8-9]。納米復(fù)合材料突破了單一組分材料性能的局限，具有體積小、比表面積大等特點(diǎn)，因而被廣泛用于制備納米復(fù)合材料標(biāo)記物進(jìn)而提高電化學(xué)分析技術(shù)的靈敏度[10]。

采用二氧化硅修飾的氧化鋅（nO@SiO2固載檢測抗體（dAb和二茂鐵甲酸（FCA制備納米復(fù)合材料標(biāo)記物 （{dAb-nO-FCA}，并將其用于放大電化學(xué)免疫分析乳制品中大腸桿菌。基于大腸桿菌與其抗體之間的特異性相互作用構(gòu)建“三明治”免疫分析模式，采用示差脈沖伏安法測定結(jié)合在電極表面的二茂鐵甲酸獲得電流信號(hào)。

1材料與方法

11儀器及試劑

二茂鐵甲酸（FCA、牛血清白蛋白（BSA、1-（3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亞胺鹽（EDC、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS購于Sigma公司；3-氨基丙基三乙氧基硅烷（APTES、正硅酸乙酯（TEOS由阿拉丁試劑公司（中國上海提供。半胱氨酸（L-cysteine購于上海晶純實(shí)業(yè)有限公司。試驗(yàn)所用其他試劑均購于上海國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

12{dAb-nO-FCA}的制備

121制備氧化鋅納米棒在攪拌條件下，將60 mL氫氧化鈉溶液（10 mol/L逐滴加到100 mL硝酸鋅溶液（004 mol/L中。隨著氫氧化鈉的加入，有白色沉淀生成，繼續(xù)滴加，沉淀溶解。室溫?cái)嚢? h后，加熱至沸騰并回流1 h。趁熱用045 μm的微孔玻璃漏斗過濾，將所得白色沉淀置于空氣中晾干至恒重。

122制備二氧化硅修飾的氧化鋅納米棒將20 mg氧化鋅納米棒分散于20 mL丙醇和40 mL乙醇的混合液中并超聲10 min。在攪拌條件下，依次加入15 mL氨水溶液（25%、320 μL TEOS和80 μL APTES，室溫下反應(yīng)8 h。將上述溶液在8 000 r/min，離心10 min制得nO@SiO2，隨后用去超純水清洗該沉淀并將其分散于20 mL磷酸緩沖溶液（PBS中。

123制備{dAb-nO-FCA}取10 mL nO@SiO2溶液，依次向其中加入10 mL 040 mol/L EDC-010 mol/L NHS混合液、40 mg/mL檢測抗體（dAb和10 mL二茂鐵甲酸飽和溶液，在37 ℃攪拌2 h。經(jīng)離心分離并洗滌后，將制得的{dAb-nO-FCA}用PBS分散并置于冰箱中4 ℃保存。

13免疫傳感器的制備

金電極（Ф=3 mm修飾前需進(jìn)行預(yù)處理：首先依次用030、005 μm的Al2O3粉末在金相砂紙上打磨拋光，再依次用乙醇、水超聲清洗，最后置于050 mol/L硫酸溶液中在 -030～15 V 電位范圍內(nèi)進(jìn)行循環(huán)伏安掃描，直至得到穩(wěn)定的循環(huán)伏安圖。把預(yù)處理過的金電極浸入002 mol/L半胱氨酸的乙酸緩沖溶液（pH 值50中自組裝6 h。取出電極用水清洗后，置于040 mol/L EDC-010 mol/L NHS的溶液中反應(yīng)1 h用于活化電極末端的羧基，然后用PBS清洗電極表面并用氮?dú)獯蹈伞?0 μL捕獲抗體（cAb溶液（10 mg/mL滴涂在金電極表面并在37 ℃下培養(yǎng)1 h后，用PBS清洗電極以除去未結(jié)合的抗體并晾干。在電極表面滴加10% BSA-PBS溶液并培養(yǎng)30 min以封閉活性位點(diǎn)。

2結(jié)果與分析

21免疫測定條件的優(yōu)化

溫度對免疫蛋白分子的活性有一定的影響，本試驗(yàn)研究了在20 ～ 45 ℃范圍內(nèi)對電化學(xué)免疫分析方法檢測大腸桿菌的影響。響應(yīng)電流隨反應(yīng)溫度的升高而逐漸增大，說明大腸桿菌和其抗體結(jié)合的速度隨著溫度的增加而提高。在35 ℃時(shí)，免疫反應(yīng)最充分，電流響應(yīng)最大。當(dāng)溫度繼續(xù)上升，響應(yīng)電流逐步下降，表明過高的反應(yīng)溫度使少數(shù)免疫分子變性或失活，導(dǎo)致修飾電極表面的大腸桿菌和其抗體部分脫落，因此選擇35 ℃為最佳免疫反應(yīng)溫度。

抗體與抗原發(fā)生免疫反應(yīng)與時(shí)間有關(guān)。本研究考察了免疫時(shí)間在20 ～ 70 min范圍內(nèi)對電化學(xué)免疫分析方法檢測大腸桿菌的影響。結(jié)果表明，響應(yīng)電流隨著免疫反應(yīng)時(shí)間的增加而增強(qiáng)，在50 min時(shí)，響應(yīng)電流趨于穩(wěn)定，因此選擇50 min為最佳免疫反應(yīng)時(shí)間。

22免疫測定的工作曲線

電化學(xué)免疫分析方法用于大腸桿菌檢測的原理，首先將捕獲抗體固定在半胱氨酸修飾的金電極表面，然后免疫結(jié)合大腸桿菌，進(jìn)而吸附{dAb-nO-FCA}構(gòu)建“三明治”免疫分析模式，最后用示差脈沖伏安法測定電極表面的二茂鐵甲酸獲得電流信號(hào)。隨著待測溶液中大腸桿菌濃度的增大，固定在電極表面的{dAb-nO-FCA}就越多，因此產(chǎn)生的電流信號(hào)就越強(qiáng)。

[JP2]在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下，將該分析方法用于檢測不同濃度的大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)溶液。二茂鐵甲酸產(chǎn)生的響應(yīng)電流隨著待測大腸桿菌濃度對數(shù)的線性關(guān)系見圖1。結(jié)果表明，二茂鐵甲酸產(chǎn)生的響應(yīng)電流與大腸桿菌濃度的對數(shù)在20×102～20×106 CFU/mL的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性回歸方程為I=[JP2]152×lgC-077，r=0984，檢出限為100 CFU/mL（S/N=3。

[F（W11][TPXA1tif][F]

23回收率試驗(yàn)

為了進(jìn)一步研究電化學(xué)免疫分析方法的實(shí)用性，本研究采用該方法對乳制品進(jìn)行了大腸桿菌加標(biāo)回收檢測。選擇加標(biāo)濃度分別為50×102、10×103、10×104 CFU/mL，測定結(jié)果見表1，該免疫分析方法與平板計(jì)數(shù)法的相對誤差在±8%以內(nèi)，計(jì)算得到其回收率為958%～1050%，表明該電化學(xué)免疫分析方法用于乳制品中大腸桿菌檢測具有可靠性好、準(zhǔn)確度高等優(yōu)點(diǎn)。

[F（W7][HT6H][J]表1乳制品加標(biāo)回收率測定[HTSS][STB]

[HJ5][BG（！][BHDFG3，W5，W18，W6W]樣品[B（][BHDWG12，W18W]加標(biāo)回收量（CFU/mL[BHDWG12，W6。3W][XXSX2-SX172]檢出量加入量測出量[BW]回收率（%

[BHDG12，W5，W6。4W]酸奶未檢出50×102479958

[BHDW]嬰兒奶粉未檢出10×1031 0501050

純奶未檢出10×1049 720972[HJ][BG）F][F）]

3結(jié)論

采用nO@SiO2作為載體固定檢測抗體和二茂鐵甲酸制備了金納米棒標(biāo)記物，并將其用于電化學(xué)免疫分析乳制品中大腸桿菌。nO@SiO2具有生物相容性好、比表面積大的優(yōu)點(diǎn)，能夠固載大量二茂鐵甲酸，從而放大電流信號(hào)提高大腸桿菌檢測的靈敏度。將該電化學(xué)免疫分析方法應(yīng)用于乳制品的加標(biāo)回收試驗(yàn)，結(jié)果令人滿意。

[HS2][HT85H]參考文獻(xiàn)：[HT8SS]

[1][（#]Yilma ，F(xiàn)aye B，Loiseau G Occurrence and distribution of species of Enterobacteriaceae in selected Ethiopian traditional dairy products：a contribution to epidemiology[J] Food Control，2007，18（11：1397-1404

[2]Martín M C，Martínez N，del Rio B，et al A novel real-time polymerase chain reaction-based method for the detection and quantification of lactose-fermenting Enterobacteriaceae in the dairy and other food industries[J] Journal of Dairy Science，2010，93（3：860-867

[3]Rieger M，Cervino C，Sauceda J C，et al Efficient hybridoma screening technique using capture antibody based microarrays[J] Analytical Chemistry，2009，81（6：2373-2377

[4]張軍瑞，陳健，劉仲明電化學(xué)發(fā)光免疫檢測技術(shù)研究進(jìn)展[J] 分析化學(xué)，2010，38（8：1219-1226

[5]Wang J Electrochemical biosensors：towards point-of-care cancer diagnostics[J] Biosensors and Bioelectronics，2006，21（10：1887-1892

[6]Lou Y，He T，Jiang F，et al A competitive electrochemical immunosensor for the detection of human interleukin-6 based on the electrically heated carbon electrode and silver nanoparticles functionalized labels[J] Talanta，2014，122：135-139

[7]劉慧杰，滕瑛巧，張新愛，等 基于Fe3O4@Au復(fù)合納米粒子標(biāo)記抗體的電化學(xué)免疫方法用于水體中大腸桿菌的檢測[J] 高等學(xué)校化學(xué)學(xué)報(bào)，2010，31（6：1131-1136

[8]hang X A，Teng Y Q，F(xiàn)u Y，et al Lectin-based electrochemical biosensor constructed by functionalized carbon nanotubes for the competitive assay of glycan expression on living cancer cells[J] Chemical Science，2011，2（12：2353-2360[