C4二羧酸全生物合成技術的研究現狀與展望

孫小龍　付永前

摘要：富馬酸、L-蘋果酸和L-天冬氨酸是3種典型的C4二羧酸，目前工業化生產富馬酸多采用化學合成法，以石油基富馬酸為平臺化合物，進一步衍生出L-蘋果酸和L-天冬氨酸。依托于石油基工業生產C4二羧酸的工藝不僅帶來較多負面問題，同時也限制了3種C4二羧酸在食品、醫藥等領域的應用。隨著生物制造技術的不斷發展，開發C4二羧酸全生物合成技術成為歷史必然。本文對生物合成富馬酸、L-蘋果酸和L-天冬氨酸的現狀及存在問題進行了綜述，并對3種C4二羧酸的全生物合成技術的可行性及發展進行了分析與展望。

關鍵詞：富馬酸；L-蘋果酸；L-天冬氨酸；生物合成

中圖分類號： Q89文獻標志碼： A

文章編號：002-302（204）2-007-04

依托于石油基工業的C4二羧酸是重要的基礎化工原料，其應用范圍已涉及到國民生活中的各個方面，儼然成為社會穩定、人類可持續發展的重要基石。富馬酸是一種典型的C4二羧酸，可廣泛應用于化工、食品、醫藥、涂料等行業，目前全世界富馬酸的需求量為00×06 t/年，我國富馬酸產能就達到了（0～5）×05 t/年，其中，有40%來自江蘇，主要生產企業包括常茂生化有限公司、宜興前成有限公司、南京利邦有限公司等，其中2/3市場份額主要用于生產不飽和樹脂、醇酸樹脂，而純度高于99%的食品級富馬酸（主要應用于酸味劑、防腐劑、抗氧化劑、pH調節劑、飼料添加劑等領域），加上醫藥級富馬酸鹽（主要應用于臨床醫學上）不足市場份額的/3。目前工業上富馬酸主要通過順酐異構和糠醛氧化等化學方法制得，其制備工藝過程普遍存在生產條件苛刻、催化劑毒性大、環境污染嚴重等缺點，嚴重破壞了人類的生存環境，同時產品的安全性限制了在食品及醫藥領域的應用。

L-蘋果酸是利用富馬酸衍生的C4二羧酸之一。國內蘋果酸的生產企業主要包括南京國海有限公司、常茂生化有限公司、恒康有限公司等，生產工藝主要采用石油基富馬酸，通過生物酶轉化合成L-蘋果酸，石油基富馬酸所存在的安全性同樣也限制了L-蘋果酸的進一步應用，然而，L-蘋果酸所具有的多種特殊生理功能，如護肝、解毒、抗疲勞、減肥等，給其發展帶來了巨大的市場空間，同時，L-蘋果酸在某些新興應用領域也具有巨大的市場，如南京國海開發的DME添加劑能抑制瘤胃酸中毒，提高飼料利用率，增加產奶量。此外，蘋果酸作為酸味劑，在某些傳統領域部分替代檸檬酸，將增加（20～30）×05 t的潛在市場[2]。

L-天冬氨酸是另外一種利用富馬酸衍生的C4二羧酸，其國內生產企業主要包括江蘇杰成生化有限公司、常茂生化有限公司等。其售價受到原油及石化原料的波動而變化，200年的售價在2 000元/t左右，現在生產工藝中原料及環保處理成本高，占到生產成本的0%～5%，并且消耗大量的硫酸和液氨，導致生產規模不能擴大。然而，天冬氨酸的聚合物聚天冬氨酸可廣泛應用于作物生長促進劑、水處理劑等領域，同時隨著L-天冬氨酸在食品醫藥等領域的不斷擴大，市場容量會持續增加，預計今后幾年需求量會達到20×05 t/年[3]。

隨著石油資源的日益枯竭和不可再生資源價格的節節攀升，發展環境友好的生物基化學品的生物制造技術已成為轉變經濟增長方式、保障生態鏈良好循環、實現經濟社會協調可持續發展的戰略需求。生物制造技術的發展，可以高效地制備替代石油化工原料的C-C4平臺化合物，進而與現代新型綠色化工技術和產業相銜接，大規模生產各種生物基化學品，實現產業結構的調整，提升傳統生物技術產業競爭力。2009年OECD“面向2030生物經濟施政綱領”戰略報告預計，到2030年，將有35%的化學品和其他工業品來自生物制造，生物經濟中生物制造產業的貢獻率將占39%，超過生物醫藥和生物農業產業。

利用生物法合成富馬酸、L-蘋果酸和L-天冬氨酸等C4二羧酸，是化工行業可持續發展的必然選擇，受制于當前成熟石油基催化工藝的相對低廉成本，生物基C4二羧酸的大規模產業化尚缺乏與化工產品全面競爭的優勢，因此，提高產品附加值是實現其產業化生產的有效途徑。隨著健康理念深入人心，在食品、醫藥領域，利用生物法合成富馬酸，繼而生產出L-蘋果酸、L-天冬氨酸等相關衍生產品更能符合人們消費需求和消費心理，市場前景廣闊。在此，本文對生物合成富馬酸、L-蘋果酸和L-天冬氨酸的現狀及存在問題進行綜述，并對3種C4二羧酸的全生物合成技術的可行性及發展進行分析和展望。

[WTHZ]生物合成C4二羧酸的國內外發展現狀

生物合成富馬酸

發酵法生產富馬酸的研究開始于20世紀初，Foster教授從分別來自8個不同屬的4株菌株中篩選出根霉菌是生產富馬酸的最佳菌株，開啟了根霉菌發酵產富馬酸的研究歷程[4]。不過由于當時技術的局限性，生物合成富馬酸還處于較低的水平，基本上處于實驗室研究階段。隨著20世紀70年代爆發第次石油危機以來，世界各國科學家都開始研究生物法替代化學法合成富馬酸。于是，選育性能優良的菌株，利用物美價廉且來源豐富的生物質發酵產富馬酸受到了越來越多的關注，意大利、德國、美國、日本等國的學者在這方面都做了大量的工作。988年，美國Duont公司申請了有關利用根霉屬真菌發酵法生產有機酸的專利，發酵碳源、氮源、無機鹽及溶氧對富馬酸的生產具有重要影響，發酵70 h后，富馬酸的最高產量達到20 g/L，但發酵液中琥珀酸、蘋果酸、α-酮戊二酸等多種雜酸含量較高，占發酵產酸比例的22%[5]。996年旋轉生物膜反應分離耦合裝置替代中和劑的使用，解除富馬酸的產物抑制效應，在20 h內生產富馬酸的平均產量多達85 g/L，但膜反應器經濟成本高，不適合工業化生產[6]。我國科學家對生物合成富馬酸的研究始于20世紀70年代中期，975年，山西微生物研究所的張俊賢篩選出株具有產富馬酸能力的Rarrhizus，并對其發酵條件進行了初步探索。當振蕩培養于含有2%的葡萄糖培養基時，富馬酸產量為535 g/L，得率為446%，同時發酵液中還含有較多的副產物L-蘋果酸[7]。

2006年以來，我們針對生物合成富馬酸工藝中存在問題進行技術攻關，在菌種優化方面，本團隊以富馬酸菌株Roryzae為主要研究對象，通過紫外誘變或化學誘變等手段，以丙烯醇、溴甲酚綠為篩選標記，獲得副產物乙醇含量低、富馬酸產量高的突變株，該菌株已申請了專利[8-9]，奠定了米根霉發酵生產富馬酸的工業化進程基礎；在菌體培養方面，針對菌種培養難的問題，建立了一套逐級放大、面向工業化應用的米根霉細胞培養策略[0]，解決了實際生產中可能存在的生物量需求問題，為自固定化米根霉產富馬酸的大規模工業化生產奠定了基礎；在發酵調控方面，建立了雙階段溶氧調控策略，即在發酵前8 h控制溶氧濃度在80%，8 h后調至30%，富馬酸產量、糖酸轉化率以及富馬酸生產強度分別達到了 562 g/L，542 % 和07 g/（L·h）。在該調控策略基礎上，進一步開發米根霉在攪拌式反應器發酵與離子交換樹脂分離耦合生產富馬酸的新型工藝路線，使富馬酸產量為 586 g/L，糖酸得率為076 g/g，生產強度72 g/（L·h），樹脂可循環使用0批次，具有操作簡便、體系穩定、操作時間長等優點[2]。

目前生物合成富馬酸的生產成本，與化工法相比還有一定差距。因此，開發廉價的生物基富馬酸合成路線，以及開發生物基富馬酸的高附加值衍生產品如L-蘋果酸、L-天冬氨酸等是未來發展方向。

2生物合成蘋果酸

20世紀初，人們發現某些酵母和曲霉在代謝過程中積累蘋果酸，隨后世界各國陸續開展了生物合成蘋果酸的研究。然而，目前發酵法生產L-蘋果酸的研究還未有重大進展，正在研究的發酵法生產L-蘋果酸的工藝主要有兩類：一是兩步發酵法，或稱轉化發酵法，先用一株菌株在糖質發酵液中產生富馬酸，然后接入另一株菌株繼續進行發酵，將富馬酸轉化為蘋果酸。一般是先用少根根霉（Rhizopus arrhizus）或華根霉（Rhizopus chinensis）把糖質原料轉化為富馬酸，然后再用膜醭畢赤酵母（ichia membranefaciens）或普通變形桿菌（roteus vulgaris）及宛氏擬青霉（aecilomyces varioti）轉化富馬酸。日本佐佐木等[3]從假絲酵母屬、德巴利酵母屬、漢遜酵母屬、畢赤酵母屬、紅酵母屬、酵母屬和球擬酵母屬的23株酵母菌中發現膜醭畢赤酵母的富馬酸轉化率最高。而有研究結果表明[4-5]，將華根霉6508接入一定培養基，在30 ℃振蕩培養 5 d，接入畢赤酵母再培養5 d，產生的蘋果酸對可發酵性糖的轉化率達625%。國內的胡純鏗等[6]用少根根霉A-23接入含有50 g/L葡萄糖培養基中3 d后，再接入普通變形桿菌V-8繼續培養2 d，L-蘋果酸濃度達733 g/L，對葡萄糖的轉化率為656%。二是以曲霉為菌種的一步發酵法。直接發酵法生產L-蘋果酸可追溯到928年，Yuill[7]報道在培養黃曲霉（Aspergillus flavus）時，有少量L-蘋果酸伴隨琥珀酸和富馬酸產生。953年，Godin[8]報道了短密青霉有產蘋果酸的能力。日本學者從20世紀50年代末起，對蘋果酸發酵生產進行了大量研究，Abe等[9]研究的發酵法產蘋果酸最高濃度達50 g/L。99年，以色列研究者[20]在6 L攪拌罐中利用黃曲霉發酵產 L-蘋果酸，通過條件優化，在葡萄糖初始濃度20 g/L、攪拌轉速350 r/min、Fe2濃度2 mg/L、氮源濃度27 mg/L、磷酸鹽濃度5 mol/L，以及中和劑CaCO3濃度90 g/L的條件下發酵培養92 h，產酸可達 3 g/L，對葡萄糖的實際摩爾轉化率為28%，但據報道該菌產生致癌性物質黃曲霉毒素，并且伴有其他四碳酸產生。然而上述利用淀粉質原料生產L-蘋果酸的微生物多為曲霉（Aspergillus sp），這些菌株大多具有糖化淀粉的能力，可以直接利用淀粉質原料，發酵工藝條件溫和，與其他L-蘋果酸制備方法相比具有自身的優勢，但其次生代謝產物中可能存在對人體及動物有致癌作用的黃曲霉毒素，倍受爭議。除利用曲霉菌外，也有人提出使用根霉菌利用糖質和營養鹽培養基培養后，在滿足發酵的諸條件下直接生產出L-蘋果酸，然而該方法還處于研究的初步階段。目前我們篩選到株相對高產出L-蘋果酸的根霉菌，該菌株富馬酸產量較低[2-22]。

由于原料成本以及技術水平的限制，以上兩種工藝均未實現工業化生產。隨著酶工程技術及固定化技術的發展，日本學者使用聚丙烯酰胺凝膠包埋產氨短桿菌細胞，首次實現了L-蘋果酸的連續化產業化生產，00 L罐中日產酸達 54 kg。該工藝是目前L-蘋果酸工業化生產的主要方法，然而，該工藝的催化底物為石油基富馬酸，安全性受到了限制，從而制約了其在醫藥、食品等領域的應用。隨著社會的進步，全生物基L-蘋果酸越來越受到廣大消費者的青睞。L-蘋果酸的全生物合成技術的研究與開發，將為L-蘋果酸在醫藥以及食品領域開拓非常廣闊的市場。

3生物合成L-天冬氨酸

自953年，L-天冬氨酸已開始采用發酵或生物催化合成進行生產。如采用基因工程大腸桿菌以葡萄糖為碳源直接發酵生產L-天冬氨酸，或利用天冬氨酸酶催化富馬酸轉氨生產L-天冬氨酸。日本科學家在這方面開展了大量工作。內尾等報道用黃色短桿菌（Brevibacterium flavum）的谷氨酸缺陷型突變株，在含36%葡萄糖的培養基中，30 ℃培養4 d，生產天冬氨酸 4 g/L[23]。椎尾等用黃色短桿菌[2]的檸檬酸合成酶缺失株[23]，在含36%葡萄糖的培養基中，30 ℃培養2 d，生產天冬氨酸06 g/L。后來他們進一步還用黃色短桿菌的丙酮酸激酶缺失株，在限制生物素條件下，培養2 d，由00 g/L葡萄糖生產天冬氨酸226 g/L。后藤等用5%葡萄糖培養基培養佛拉氏鏈霉菌生成天冬氨酸0 g/L。木下等用營養培養基或其中加05%富馬酸的培養基，培養巨大芽孢桿菌 d后，添加富馬酸的氨水中和液，繼續培養3 d生成天冬氨酸06 g/L。

與發酵法相比，酶催化具有生產工藝簡單、副產物少、易于分離精制等優點，菌種的篩選也較發酵法簡單易行。木住等最先使用酶催化轉化法生產天冬氨酸，即在富馬酸鈉和氯化銨的混合溶液中，添加啤酒酵母，利用啤酒酵母的天冬氨酸酶催化制得天冬氨酸[24]。后來，北原等用天冬氨酸酶活性高的大腸桿菌突變株的凍干菌體，由富馬酸制得了天冬氨酸。接著又發現十六烷基吡啶氯化物之類的表面活性劑、高級脂肪酸等能夠增加天冬氨酸收率。另外，他們還找到一種三葉假單孢菌，該菌不加表面活性劑，也能進行酶反應，培養該菌株，每升培養液可生產400 g天冬氨酸。一些研究結果還表明，可以用好熱細菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌及短桿菌的α-氨基正丁酸抗性突變株的天冬氨酸酶，將富馬酸轉化為天冬氨酸[25]。但由于分離和固定化天冬氨酸酶的穩定性不好，973年日本田邊制藥株式會社把細胞固定在聚丙烯酰胺上，得到固定化全細胞作為催化劑，該工藝是第一個成功的固定化全細胞應用實例，開創了應用生物催化法生產氨基酸的先河。

日本學者高尾等人曾經開展過雙菌發酵生成天冬氨酸的研究，該方法先用葡萄糖培養根霉菌進行富馬酸發酵，然后接入天冬氨酸酶活性高的普通變形桿菌進行培養，把富馬酸轉化為天冬氨酸，最后生成天冬氨酸499 g/L，對初始糖收率為624%。該研究具有重要意義，在雙菌偶聯發酵上進行了一個有效的探索，但是天冬氨酸的最終濃度及對初始糖的轉化率不是太高，難以實現工業化生產。

[WTHZ]2全生物合成C4二羧酸技術的發展趨勢

生產成本高，缺乏與同類石油基產品的價格競爭優勢是困擾絕大多數生物基大宗化學品產業化進程的世界難題。然而，隨著健康理念深入人心，在食品、醫藥領域，利用生物法合成富馬酸，針對生產成本高，無價格優勢等特點，以降低大規模產業化的生產成本為核心，重點開發低廉高效的富馬酸生產工藝，繼而生產L-蘋果酸、L-天冬氨酸等衍生產品的全生物合成路線更能符合人們消費需求和消費心理。

2生物合成富馬酸的廉價工藝開發

生產成本高是阻礙生物基富馬酸產業化的重要因素，降低原料成本以及提高菌種的產酸能力成為解決這一問題的關鍵點。以往的研究往往單純依賴于發酵工藝的調控，以提高糖酸轉化率，增強原料的利用率，所采用的原料基本為價格相對較貴的葡萄糖，發酵法制備富馬酸的成本居高不下，開發廉價的生物合成富馬酸路線將是降低生產成本的有效方法之一，其主要體現在：（）基于廉價原料的富馬酸低成本制備技術， 采用離子注入、飛秒激光誘變或常壓室溫等離子體誘變等技術，選育高糖化酶活力富馬酸生產菌株的育種思路，以期實現以廉價淀粉質原料發酵生產富馬酸的工藝過程，拓寬米根霉發酵產富馬酸的底物譜，從源頭降低發酵成本；結合米根霉發酵產酸的特性，篩選合適的淀粉質原料，優化同步糖化工藝，實現米根霉利用廉價淀粉質原料高效積累富馬酸的工藝路線，基于過程控制等關鍵技術，完成同步糖化工藝的生產方法，全面降低發酵法制備富馬酸的成本；（2）基于殼聚糖/殼聚糖-富馬酸聯產的木質纖維素全煉制技術 采用蒸爆、酸解等技術對非糧生物質資源進行預處理，實現葡萄糖、木糖的有效分離。解析原料預處理液（主成分為木糖）中各種成分對米根霉生物量積累及殼聚糖/殼寡糖合成的作用機理，提高殼聚糖/殼寡糖的積累量，同時進一步優化米根霉利用酶解液（主成分為葡萄糖）發酵產酸，在完成分步利用非糧生物質中木糖、葡萄糖聯產殼聚糖/殼寡糖與富馬酸的工藝基礎上，實現非糧生物質全利用。目前，我們突破傳統富馬酸的生產思路，創新性地提出了雙階段利用玉米秸稈中木糖、葡萄糖的工藝路線，木糖用于米根霉生物量的培養，從而收獲殼聚糖/殼寡糖，葡萄糖用于米根霉的發酵產酸過程，實現富馬酸的積累。該方法突破了傳統方法對木質纖維素的利用局限，充分發揮菌株特性，建立秸稈類原料聯產殼聚糖/殼寡糖和富馬酸的工藝路線，開拓木質纖維素的利用范圍，為木質纖維素的高效利用提供新的方向[26-27]。

22全生物合成L-蘋果酸以及L-天冬氨酸

傳統工藝中，富馬酸的生產與L-蘋果酸/L-天冬氨酸的生成是兩個獨立的過程，發酵法生產富馬酸多采用鈣鹽法作為中和劑，后經濃縮、結晶進一步轉化為L-蘋果酸/L-天冬氨酸，環境污染嚴重、能耗大。采用發酵-酶法耦合轉化生產工藝，串聯富馬酸的發酵過程及酶轉化過程，將是解決全生物合成L-蘋果酸/L-天冬氨酸問題的關鍵，我們已嘗試利了用富馬酸發酵液來生產L-天冬氨酸，并取得了初步效果[3]。因此在后期的研究，主要研究方向：（）發酵-酶法轉化耦合生產L-蘋果酸/L-天冬氨酸，采用雙步走的技術策略，以銨鹽/鈉鹽替換傳統工藝中的鈣鹽，或以反應分離耦合的方式獲得富馬酸鈉/富馬酸銨，直接進入下游的酶法轉化過程，生產L-蘋果酸/L-天冬氨酸；（2）高效細胞催化技術，解決現有生產工藝中固定化酶使用壽命短、底物富馬酸分離難度大等問題，研究不同固定化方式、不同固定化顆粒大小對底物、產物擴散速率的影響，固定化對細胞催化轉化能力的影響，在不影響傳質的同時防止酶的泄露，延長固定化細胞的使用壽命。

3展望

社會發展至今，人類開始追尋“源于自然、回歸自然”的生活理念，要求“吃的健康、用的安心”，在這樣一種消費理念下，應用于食品、飼料、醫藥等領域的各類石油基產品受到了嚴重質疑，而以生物質原料為基礎的現代工業生物產品具有原料來源自然化，生產過程溫和化的典型特征，能夠滿足人類對健康、自然的追求，符合消費者的消費需求和心理，具有較強的市場接受度。故借助微生物的自然潛能，將天然生物質資源轉化成富馬酸、L-蘋果酸、L-天冬氨酸在食品、飼料、醫藥等各大行業中將具有強勁的競爭優勢。因此，建立以生物質為原料聯產富馬酸及下游高附加值衍生產品（L-蘋果酸、L-天冬氨酸）的工業微生物技術研究與應用，提升C4二羧酸高端化學品的生物制造技術水平，也將是未來C4二羧酸的研究方向和發展趨勢。

[HS2][HT85H]參考文獻：[HT8SS][H3mm]

[ZK（#]付永前 米根霉發酵與離子交換樹脂分離耦合生產富馬酸的研究[D] 南京：南京工業大學，2009

[2]何皓 米根霉直接發酵產L-蘋果酸的代謝調控研究[D] 南京：南京工業大學，2009

[3]盛曉燕 利用富馬酸發酵液制備L-天冬氨酸的工藝探索[D] 南京：南京工業大學，200

[4]Foster W，Waksman S A The production of fumaric acid by molds belonging to the genus Rhizopus ournal of the American Chemical Society，938，6：27-35

[5]Lorraine B，Ling N D，Thomas K N，et al Fermentation process for carboxylic acids：US，487773 988-08-09

[6]Cao N，Du ，Gong CS，et al Simultaneous production and recovery of fumaric acid from immobilized Rhizopus oryzae with a rotary biofilm contactor and an adsorption column Applied and Environmental Microbiology，996，62（8）：2926-293

[7]張俊賢，蔣明珠，白照熙，等 無根根霉R25產延胡索酸的發酵條件 食品與發酵工業，988（5）：4-2

[8]Fu Y Q，Xu Q，Li S，et al Strain improvement of Rhizopus oryzae for over-production of fumaric acid by reducing ethanol synthesis pathway Korean ournal of Chemical Engineering，200，27（）：83-86

[9]黃和，高振，李霜，等 一種富馬酸產生菌及其誘變篩選方法和應用：中國，CN000645 2008-0-09[ZK）]

[0][ZK（#]Fu YQ，Xu Q，Li S，et al A novel multi-stage preculture of Rhizopus oryzae ME-F2 strategy in the STR for fumaric acid production World ournal of Microbiology & Biotechnology，2009，25：87-876

Fu Y Q，Li S，Chen Y，et al Enhancement of fumaric acid production by Rhizopus oryzae using a two-stage dissolved oxygen control strategy Applied Biochemistry and Biotechnology，200，62（4）：03-038

[2]黃和，付永前，李霜，等 一種分離提取富馬酸的方法：中國，CN0235394 2008-08-06

[3]王博彥，金其榮 發酵有機酸生產與應用手冊[M] 北京：中國輕工業出版社，2000：540-567

[4]Takao S，Hotta K Conversion of fumaric acid fermentation to L-malic acid fermentation by the association of Rhizopus arrhizus and roteus vulgaris Ferment Bioeng，976，54：79-204

[5]Takao S，Yokota A，Tanida M L-malic acid fermentation by a mixed culture of Rhizopus arrhizus and aecilomyces varioti Ferment Bioeng，983，6：643-645

[6]胡純鏗，王國川 混合培養發酵L-蘋果酸的研究 華僑大學學報：自然科學版，2000，2（）：76-79

[7]Yuill L Alcoholic fermentation by Aspergillus flavus，Brefeld Biochemical ournal，928，22（6）：504-507

[8]Godin Study of ternary metabolism in enicillium brevicompactumⅢ roduction of a polysaccharide by this mold Biochimica et Biophysica acta，953，2（4）：528-532

[9]Abe S，Furuya A，Saito T，et al Method of producing L-malic acid by fermentation：US，306390 962-0-02

[20]Battat E，eleg Y，Bercovitz A，et al Optimization of L-malic acid production by Aspergillus flavus in a stirred fermentor Biotechnology and Bioengineering，99，37（）：08-6

[2][3]何皓，李霜，徐晴，等 放線菌酮對米根霉積累L-蘋果酸代謝途徑的調控作用 過程工程學報，2009，9（）：53-56

[22]何皓，李霜，徐晴，等 積累L-蘋果酸的米根霉突變株酶活性初探 微生物學通報，2009，36（3）：36-39

[23]Lee K M，Ramalingam K，ong-Keun S，et al A highly efficient and large-scale synthesis of（2S，3S）-[2，3-2H2]-and（2S，3R）-[3-2H] aspartic acids via an immobilized aspartase-containing microbiol cell system ournal of Organic Chemistry，989，54（3）：395-398

[24]Tsao G T，Cao N ，Du ，et al roduction of multifunctional organic acids from renewable resources Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology，999，65：243-280

[25]Fujji G， Nishibayashi H reparation of DL-aspartic acid：，0724725 994-05-07

[26]Xu Q，Li S，Fu Y Q，et al Two-stage utilization of corn straw by Rhizopus oryzae for fumaric acid production Bioresource Technology，200，0（5）：6262-6264

[27]南京工業大學 一種利用木質纖維素生產甲殼素/殼聚糖的方法：中國，CN0575627 2009