清脂護肝方對大鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用研究

何紅梅 屈莉紅 邵建國 陳琳 李民 張玲燕 顧春燕

清脂護肝方對大鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用研究

何紅梅 屈莉紅 邵建國 陳琳 李民 張玲燕 顧春燕

目的 探討清脂護肝方對大鼠非酒精性脂肪性肝炎的作用及其機制。方法 58只雄性SD大鼠，均喂養高脂飼料，予12只作對照。將造模成功的大鼠再隨機分為模型組、低劑量、中劑量和高劑量清脂護肝方組，分別給予0.9%NaCl溶液灌胃，清脂護肝方組予清脂護肝方藥液灌胃6周；觀察記錄大鼠的行為表現及體質量變化。干預結束后次日處死所有大鼠并留取血清和肝臟，檢測清脂護肝方對N A S H大鼠肝生化指標的影響。免疫組織化學方法檢測N A S H大鼠肝組織中SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達水平。體外實驗：對庫普弗細胞株采用不同濃度不同時間的C Cl4刺激，用優選方案的清脂護肝方藥物血清培養后檢測SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達。結果 與正常對照組相比，模型組大鼠體質量明顯增加（P＜0.05）；模型組A L T、A ST、T Bil均較正常對照組升高（P＜0.05）；模型組T G、C H、L D L均明顯上升（P＜0.01），H D L亦有所降低（P＜0.05）。與模型組相比，中大劑量清脂護肝方組體質量均有減輕，其中大劑量組的體質量減輕最為明顯（P＜0.01）；清脂護肝方各劑量治療組A L T與模型組比較明顯降低（P＜0.01），大劑量治療組A ST與模型組比較明顯降低（P＜0.01）；清脂護肝方中、大劑量組的血清T Bil較模型組顯著下降（P＜0.01）；與模型組比較，清脂護肝方組的T G、L D L有所降低（P＜0.05），尤其大劑量組降低相對更明顯；清脂護肝方各劑量組C H有所降低，但僅有大劑量組差異有統計學意義（P＜0.05）。IC C結果表明，Lyn、H ck在庫普弗細胞中有表達，并與炎癥程度呈正相關，清脂護肝方藥物血清培養后表達減少，Fgr和SSeC K S在庫普弗細胞中無明顯表達。IC C結果表明，H ck、Lyn在正常肝臟組織中低表達，模型組中高表達，用藥組無論是大、中、小劑量組，在抑制H ck、Lyn兩種Src相關激酶成員的陽性表達方面有顯著效果，特別是大劑量組，與模型組比較有顯著意義（P＜0.01）；模型組SSeC K S蛋白的表達顯著低于正常對照組，在治療組中的表達介于模型組和正常對照組，同時伴隨Lyn、H ck表達的升高呈減少趨勢，提示SSeC K S 與Src家族相關激酶（Lyn、H ck）存在某種上下游抑制關系；而清脂護肝方對Fgr的表達無明顯影響，用藥前后差異無統計學意義（P＞0.05）。結論 清脂護肝方能減輕肝臟的炎性反應，明顯改善肝功能和血脂指標，其機制可能與SSeC K S、Lyn、H ck信號通路有關，且高劑量時療效更優。

清脂護肝方；非酒精性脂肪性肝炎；肝功能；血脂；SSeC K S、Lyn、H ck、Fgr

非酒精性脂肪性肝炎（N A S H）是指肝細胞脂肪變性、小葉和（或）匯管區炎性反應，有時伴有M allory小體形成和肝纖維化的一種病理狀態。有關N A S H的發病機制迄今為止尚未闡明，近年來的研究更傾向于“多重打擊論”的學說［1］。中醫認為，N A S H乃濕、痰、瘀互阻而發病，根據其發病機制，遵循中醫學辯證施治的原則，清脂護肝方用于治療N A S H療效顯著［2］。

Src家族由Lyn相關激酶（Lyn、H ck、Lck和Blk）、Src相關激酶（Src、Yes、Fyn和Fgr）和3種Src家族激酶相關的激酶（Brk、Frk和Srm）等共11個成員組成［3］。它們構型相似，有相同的功能域，共同參與細胞的轉化以及細胞內信號轉導的過程，參與機體多種重要的生理功能。相關文獻表明，Src家族相關激酶中H ck、Lyn、Fgr主要存在于單核巨噬細胞等炎性細胞中，并與庫普弗細胞的激活關系密切［4］；Src抑制的蛋白激酶c的底物（SSeC K S）是一種細胞骨架蛋白，調節蛋白激酶A（P K A）、蛋白激酶C（P K C）信號通路，在肝纖維化模型肝星狀細胞及肝臟炎癥組織中的庫普弗細胞中有一定的表達［5-6］。本課題組在前期研究中發現，在L PS誘導的急性肝損傷中，SSeC K S表達上調，并與LPS呈劑量依賴關系（5 m g/kg表達最高），說明SSeC K S與肝臟的炎性反應有關。腹腔注射C Cl4誘導的大鼠肝纖維化模型發現，在活化的肝星狀細胞中，SSeC K S表達明顯增加；體外實驗證實，SSeC K S參與星狀細胞的活化、肝纖維化的發生、發展［5-7］。同時發現，H ck，Lyn在庫普弗細胞中有表達。本研究初步分析清脂護肝方可能會影響N A S H的相關指標，包括肝功能、血脂、SSeC K S分子和H ck、Fgr、Lyn的表達，探討其對N A S H的影響及其機制。

材料和方法

一、實驗動物及細胞

2月齡58只雄性SD大鼠（南通大學醫學院動物實驗中心提供，體質量180～240 g）除對照組12只，其余均喂養高脂飼料［8］（80.5%普通飼料、2%膽固醇、12%豬油、5%蛋黃粉、0.5%膽酸鈉）制備N A S H模型，8周后隨機抽取6只模型大鼠和2只正常大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，取下肝臟做病理切片，驗證造模是否成功。將余下的40只造模成功的大鼠按體質量隨機分成模型組，清脂護肝方低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組10只；模型組和對照組均予以0.9%NaCl溶液灌胃，清脂護肝方組分別以2.43 g· kg-1·d-1、12.15 g·kg-1·d-1、24.3 g·kg-1·d-1灌胃6周，給藥期間均喂以正常飼料。

實驗庫普弗細胞是R A W 264.7小鼠的細胞株，由上海仁濟醫院消化病研究所馬雄教授所贈與。

二、取材及標本檢測

取正常對照組、模型組及清脂護肝方低劑量組、中劑量組、高劑量組肝組織用10%中性甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，IH C法檢測肝組織中H ck、Lyn、Fgr、SSeC K S的表達。

三、檢測方法

1.肝功能及血脂：采用日本O L Y M P U S全自動生化分析儀及配套試劑檢測。

2.IH C法檢測N A S H大鼠肝組織中SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達水平：造模成功后取肝臟組織用中性甲醛溶液固定，處理，包埋，切片，脫蠟，組織片烤干后，脫色水化，熱修復（Tris-E D T A緩沖液p H 9.0抗原修復液購買于上海基因科技公司），加一抗（Lyn抗體，1∶400，ab40660，A B C A M公司；SSeC K S抗體，1∶2000，ab49849，A B C A M公司；H ck抗體，1∶600，sc-72，S A N T A公司；Fgr抗體，1∶600，H 00002268-M 01，N O V U S公司）于4℃下過夜，次日加二抗（中國福州邁新生物技術開發有限公司），1 h后用沖片，加D A B顯色劑（中國福州邁新生物技術開發有限公司），在顯微鏡下觀察顯色情況，顯色后用蒸餾水終止染色，將顯色后的組織片放入蘇木素中復染1 min，自來水清洗5 min。將組織片依次放入100%乙醇，二甲苯1，二甲苯2中脫水，封片，顯微鏡下觀察及攝片。

3.IC C法檢測庫普弗細胞中SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達水平：對庫普弗細胞株采用不同濃度不同時間的C Cl4刺激，用含20%清脂護肝方藥物血清培養后刺激固定爬片細胞，用蒸餾水洗滌細胞爬片5 min×1次，PBS浸泡5 min；滴加3%H2O2去離子水，室溫孵育30 min。PBS洗5 min×3次；滴加0.3% Triton X-100（全液用蒸餾水稀釋）通透30 min；PBS 洗5 min×3次；滴加一抗（Lyn 1∶600，H ck 1∶600，SSeC K S 1∶2000，Fgr 1∶800），4℃過夜。PBS洗5 min×3次；滴加二抗，室溫1 h。PBS洗5 min×3次；D A B顯色液按A：（A+B）=1∶50配制，混勻，鏡下顯色觀察。蒸餾水終止；蘇木素染75 s。自來水充分沖洗；依次在75%乙醇→85%乙醇→95%乙醇→100%乙醇→二甲苯中浸泡2 min脫水；封片，顯微鏡下觀察及攝片留圖。

四、統計學分析

應用SPSS19.0軟件進行數據分析。計量資料如呈正態分布或近似正態分布，以±s表示，兩組均數比較用t檢驗，多組均數比較用方差分析；P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

一、大鼠一般情況

模型組大鼠造模后出現急躁易激怒，活動減少，腹部膨隆，精神不振，飲食量減少，尿色黃，便稀味臭，體質量增加。正常對照組大鼠一般狀態良好，反應靈敏，體質量增加，飲食及二便正常。治療組從治療給藥起，狀態好轉，大便逐漸正常，整體觀察介于模型組與正常對照組間。

二、清脂護肝方對N AS H大鼠肝功能及血脂的影響

1.肝功能：模型組大鼠A L T、A S T、T Bil均較正常對照組升高（P＜0.05）。清脂護肝方各劑量治療組A L T與模型組比較明顯降低（P＜0.01），大劑量治療組A S T與模型組比較明顯降低（P＜0.01），各組Alb水平無明顯差異。中、大劑量組的血清T Bil較模型組顯著下降（P＜0.01），但小劑量組較模型組無明顯差異（P＞0.05）。見表1。

2.血脂：與正常對照組比較，模型組T G、C H、L D L均明顯上升（P＜0.01），H D L與模型組比較有所降低（P＜0.05），清脂護肝方組的T G、L D L有所降低（P＜0.05），尤其大劑量組降低相對更明顯，各治療組間H D L無明顯差異（P＞0.05）；清脂護肝方各劑量組C H均有所降低，見表2。

三、IC C法檢測SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達

Lyn、Hck在庫普弗細胞中有表達，并與炎癥程度呈正相關，清脂護肝方藥物血清培養后表達減少，Fgr和SSeC KS在庫普弗細胞中無明顯表達。詳見圖1～圖4。

表1 清脂護肝方對各組大鼠肝功能的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

表2 清脂護肝方對各組大鼠血脂的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

四、IH C法檢測N A S H大鼠肝組織中SSeC K S、H ck、Lyn、Fgr的表達

模型組SSeC K S蛋白在肝組織中的表達顯著低于正常組，在治療組中的表達介于模型組和正常對照組之間，但差異無統計學意義（r=8.004，P=0.601）；模型組的H ck、Lyn蛋白在N A S H大鼠肝組織中的表達顯著高于正常組，在治療組中的表達介于模型組和正常組，其中大劑量組差異有統計學意義（P＜0.05），中小劑量與模型組間差異無統計學意義（P＞0.05）；Fgr各組均為陰性表達，組間差異無統計學意義。見圖5～圖8。

討 論

清脂護肝方主要由9種中藥組成，其中黃連、黨參、黃芪和仙靈脾共為君藥，有清胃熱、健脾益氣、溫腎以助脾運化痰之功；紅花、赤芍、川芎共為臣藥，有活血化瘀、行氣疏肝之功；枸杞子、生山楂為佐使藥，有調補肝腎、消食滯之效。實驗發現：與正常對照組相比，模型組大鼠體質量明顯增加，與模型組相比，中大劑量組體質量均有減輕，其中大劑量組的體質量減輕最為明顯，說明清脂護肝方有減輕體質量的作用，可能與清脂護肝方中的山楂等有健脾消食的作用相關。

A L T是反映肝功能的可靠指標，N A S H時因肝實質細胞的脂肪變性及炎性反應，肝功能受到損害，A L T升高，但若病變嚴重進展到重癥肝壞死，肝細胞不能產生轉氨酶，出現膽紅素明顯升高而A L T可僅輕度升高，這種“膽酶分離”常提示療效不良。但是A L T水平與肝臟病理改變沒有明確相關性。與正常對照組相比，模型組中A L T明顯升高，說明高脂飲食確實會損傷肝功能情況，清脂護肝方治療后A L T水平均有明顯下降。A S T除在心肌及骨骼肌中表達外，在肝細胞線粒體中也有表達，因此A S T也是反映肝功能的一項重要指標。實驗結果示模型組比正常對照組的A S T水平明顯升高，而不同劑量治療組在降低A S T方面起了重要作用。Alb、T Bil也是反映肝功能的重要指標，T Bil在治療后也有明顯差異，主要體現在中大劑量組，而小劑量組并無明顯差異，Alb在正常組及模型組、模型組與治療組之間沒有明顯差異，且均在正常范圍內，說明高脂處方未能改變大鼠的Alb指標，考慮原因為造模時間的影響。本研究還發現，模型組血清C H、T G、L D L水平較正常組升高（P ＜0.05），H D L較正常組降低（P＜0.05），治療組C H、T G水平明顯降低（P＜0.05），而H D L水平有增高的趨勢（P＞0.05），在降低C H、T G、L D L指標方面治療組有良好效果，大劑量組相對更好。但治療前后未能增加H D L的表達，結合目前關于L D L、H D L尚未有明確參考標準，無法判斷實驗前后大鼠內L D L、H D L水平是否到達病理水平，所以亦無法評估清脂護肝方對此兩個指標的影響。

對Src家族的檢測發現，H ck、Lyn在正常肝臟組織中低表達，模型組中高表達，用藥組無論是大、中、小劑量組，抑制Lyn、H ck表達有顯著效果，特別是大劑量組；推測清脂護肝方可能通過Lyn、H ck信號通路下調炎性因子的表達水平，從而發揮抗炎作用，且該作用與藥物劑量有關。模型組的SSeC K S蛋白表達顯著低于正常對照組，在治療組中的表達介于模型組和正常組，同時伴隨Lyn、H ck表達的升高呈減少趨勢，提示SSeC K S與Src家族相關激酶（Lyn、H ck）存在某種上下游抑制關系；表明清脂護肝方能提高SSeC K S的表達，從而減輕炎性反應，且以大劑量組效果最好；而清脂護肝方對Fgr的表達無明顯影響。

綜上所述，清脂護肝方能減輕肝臟的炎性反應，明顯改善肝功能和血脂，其機制可能與SSeC K S、Lyn、H ck信號通路有關，且高劑量時療效更優。

1 巫協寧.非酒精性脂肪性肝炎的發病機制新說：多重打擊論和治療展望.中華消化雜志，2014，34：206-209.

2 李民，達坤林，徐建中，等.清脂護肝方治療非酒精性脂肪肝療效觀察.中國美容醫學，2010，19：23.

3 Ingley E.Src fa mily kinases：regulation of their activities，levels and identification of new path ways.Biochim Biophys Acta，2008，1784：56-65.

4 O kutani D，Lodyga M，H an B，et al.Src protein tyrosine kinase fa mily and acute infla m matory responses.A m J Physiol Lung Cell M ol Physiol，2006，291：129-141.

5 蔣文，宋磊，邵建國，等.肝星狀細胞SSeC K S的表達及其在肝纖維化中的作用.中華內科雜志，2008，47：570-573.

6 黃曉冬，朱順星，劉海鷗.非酒精性脂肪性肝病大鼠肝臟SSeC K S的表達.交通醫學，2009，23：465-467.

7 蔣文，邵建國，劉海歐等.脂多糖刺激大鼠肝組織后Src抑制的蛋白激酶C底物的表達變化.中華肝臟病雜志，2008，16：57-58.

8 孫林林，石軍，郝菁華，等.高脂飲食致大鼠非酒精性脂肪性肝炎肝纖維化模型的建立.臨床肝臟病學，2011，27：254-257，272.

Role of Qingzhi Hugan Prescription in nonalcoholic steatohepatitis of rats model

H E H ong-mei，Q U Li-hong，S H A O Jian-guo，C H E N Lin，LI Ming，Z H A N G Ling-yan，G U Chun-yan. N anjing University of Traditional Chinese M edicine，N anjing210046，China

S H A O Jian-guo，E m ail：shaojianguo4144@163.com

Objective To investigate the role and mechanism of Qingzhi H ugan Prescription in nonalcoholic steatohepatitis of rats m odel.M ethods In vivo experiment：Fifty-eight SD male rats except control group，all rats were treated with high-fat for 8 weeks and the m odels were established.The m odels were rando mized into m odel group，Qingzhi H ugan Prescription groups（large，mediu m and small dose）.The m odel and control group were gavaged with 0.9% NaCl solution.The Qingzhi H ugan Prescription groups were gavaged with decotions for 6 weeks.The m ouse changes in body weight and behaviors were recorded.The next day after the end of the intervention，all rats were sacrificed and the seru m and livers were obtained.The expression of H ck，Lyn，Fgr and SSeC K S in the rat liver tissue were deceted by im m unohistochemistry.In vitro experiment：m odel group of K upffer cells after stim ulation with different concentrations at different times of C Cl4 were training with optimization of the Qingzhi H ugan Prescription medicatedseru m，the expression of H ck，Lyn，Fgr and SSeC K S in kupffer cells were deceted by im m unocytochemistry.Results Co m pared with the control group，the m odel group weight was obviously increased（P＜0.05），A L T，A ST，T Bilin rats m odel group were higher than control group（P＜0.05）.Co m pared with normal control group，the T G，C H and L D L of m odel group were significantly increased（P＜0.01），and H D L was reduced （P＜ 0.05）.Co m pared with the m odel group，the T G，L D L of Qingzhi H ugan Prescription groups were reduced（P＜0.05），especially high dose group；The C H of each dose group of Qingzhi H ugan Prescription was decreased，but only the large dose group was statistically difference（P＜0.05）.The results of IC C showed that：Lyn，H ck were expressed in kupffer cells，and associ-ated with inflam mation was positively，after training with the Qingzhi H ugan Prescription medicated seru m，the expression were reduced.But the expression of Fgr and SSeC K S was not obvious in kupffer cells.The results of IH C indicated that：co m pared with m odel group，w hatever the large，mediu m and small dose of the Chinese medicine groups，especially the large dose of Qingzhi H ugan Prescription group，the positive expression of H ck and Lyn were decreased markedly（P＜0.01）；Co m pared with the normal group，the expression of SSeC K S in m odel group was decreased markedly；In the Chinese medicine groups，the SSeC K S were expressed between the m odel group and normal group；It showed a trend of decrease along with the rise of the expression of Lyn and H ck in the rat liver tissue with nonalcoholic fatty liver disease；Co m pared with m odel group，effect of Qingzhi H ugan Prescription on the expression of Fgr was insignificant（P＞0.05）. Conclusion Qingzhi H ugan Prescription especially the large dose group can efficiently im prove the inflam matory reaction in the rats m odel of nonalcoholic steatohepatitis，liver function，blood lipids index were im proved significantly，and the mechanism may be related with SSeC K S、Lyn and H ck signaling path ways.The higher the dose，the m ore significant the efficacy.

Qingzhi H ugan Prescription；Nonalcoholic steatohepatitis；Liver function；Blood lipids；SSeC K S、Lyn、H ck、Fgr

2015-01-23）

（本文編輯：錢燕）

江蘇省科技廳面上項目（B K2011394），南通市科技局社會發展計劃項目（K11907）

210046 南京中醫藥大學第一臨床醫學院（何紅梅，第一作者）；上海市同濟大學附屬東方醫院（屈莉紅，共同第一作者）；江蘇省南通市第三人民醫院（邵建國，陳琳，李民，顧春燕）；江蘇省南通市第六人民醫院（張玲燕）

邵建國，E mail：shaojianguo4144@163.co m