膽汁淤積小鼠模型的探討

張慧 卞兆連 王綺夏 廉哲雄 馬雄

膽汁淤積性肝病在臨床中較為常見，它可由多種原因引起，例如：肝細胞、毛細膽管、肝內膽管以及肝外膽管任何部位器質性或功能性異常，致使膽汁排泄障礙、膽汁流量減少、膽汁成分返流入血液中［1］。膽色素在肝細胞組織中蓄積，引起一系列器質性損害，導致代謝紊亂和功能異常。此狀態若持續發展將導致肝小葉和血管結構破壞、結締組織隔形成，最終肝硬化，患者預后差［2，3］。因此膽汁淤積性肝病小鼠模型的建立對于深入研究膽汁淤積性肝病具有重要意義。

資料和方法

一、實驗動物

6～8周齡的SPF級雄性C57BL/6小鼠，購自中國科學院上海分院斯萊克實驗動物中心。C57BL/6 dnTGF－βR II轉基因小鼠由中國科學技術大學免疫學研究所廉哲雄教授惠贈。上述實驗動物均于上海交通大學醫學院附屬仁濟醫院實驗動物中心SPF級動物實驗室內喂養。溫度20～24℃，濕度50%左右，12 h光照周期單籠喂養，自由飲食和飲水。所有小鼠適應性正常飲食1周后，根據隨機數字表法分組，每組10只。

二、方法

（一）BDL模型小鼠 3.5%水合氯醛腹腔內注射麻醉小鼠后，打開腹腔。顯露十二指腸上段膽總管，于肝門部解剖分離肝門靜脈和膽總管，剝離膽總管周圍組織。造模組小鼠以6個“0”的絲線結扎膽總管后關閉腹腔。假手術對照組打開腹腔后僅解剖游離膽總管但不需將其結扎，隨即關閉腹腔。所有手術操作均在無菌條件下進行，兩組小鼠術后均給予普通飼料喂養，自由攝取食物和水。10 d后頸椎離斷處死小鼠，取肝臟石蠟包埋行HE染色。

（二）DDC模型小鼠［4］喂養含有0.1%DDC飼料兩周后頸椎離斷處死小鼠，取肝臟石蠟包埋行HE染色。

（三）2OA－BSA 模型小鼠［5］稱取100μg 2OABSA溶于50μL磷酸鹽緩沖液（PBS）中，之后加入含H37RA結核分枝桿菌（購自美國Sigma－Aldrich，St.Louis，MO）濃度為1 mg/mL的完全弗氏佐劑50μL。上述100μL充分混勻后對小鼠進行腹腔內注射，100μL/只。初次2OA－BSA免疫當天及第3天，每只造模小鼠腹腔內注射溶于100μL PBS的百日咳毒素（含 量 100 ng，購 自 List Biological Laboratories，Campbell，CA）。第3周時再次以100μg 2OA－BSA（溶于50μL PBS），并輔以50μL不完全弗氏佐劑，對造模小鼠腹腔內注射，100μL/只。正常對照組小鼠則予以相同容積的溶劑為對照液。第8周時頸椎離斷處死小鼠，取肝臟石蠟包埋行HE染色。

（四）dnTGF－βR II轉 基 因 小 鼠 取 16 周 齡C57BL/6背景dnTGF－βR II轉基因以及其野生對照小鼠行頸椎離斷處死，取肝臟石蠟包埋行HE染色。

三、肝臟組織樣品采集及處理

頸椎離斷處死小鼠后迅速開腹取出肝臟，部分肝右葉組織置于4%甲醛中固定，石蠟包埋、切片，HE染色后光鏡下觀察匯管區以及膽管周圍淋巴細胞的浸潤情況，判斷肝臟的組織學病變。400倍光鏡下對肝組織匯管區炎性細胞進行計數。肝組織匯管區炎癥分級統計標準如下：0級：匯管區無或基本無炎性細胞；1級：匯管區極少量炎性細胞浸潤；2級：匯管區少量炎性細胞浸潤；3級：匯管區中等程度的炎性細胞浸潤；4級：匯管區擴大，大量炎性細胞浸潤。

四、統計學方法

采用GraphPad Prism5.0軟件處理數據及作圖，匯管區淋巴細胞數以均值±標準差表示，兩組間比較采用t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、BDL模型小鼠

模型組小鼠膽總管結扎后進食量減少，毛發散亂無光澤，少動并且對聲、光刺激反應減弱，尿液逐漸呈濃茶樣改變。假手術對照組無上述異常改變。肝臟大體標本BDL組小鼠肝臟明顯腫大，肝包膜緊張、邊緣鈍、棕黃色，質稍硬。對照組則肝臟體積正常，包膜無緊張，質軟，切面紅潤、細膩。HE染色后光鏡下可見BDL組小鼠肝組織表現為肝細胞腫脹、空泡變性，出現凝固性壞死灶。匯管區及膽管周圍炎性細胞浸潤，膽管周圍纖維化（圖1A）；而對照組肝組織匯管區和膽管周圍無或極少量炎性細胞浸潤。小鼠匯管區炎癥分級BDL模型組為（2.7±0.5）；假手術對照組為（0.0±0.0），差異有統計學意義（P＜0.01）。

二、DDC模型小鼠

隨時間延長造模組小鼠出現厭食少動、反應遲緩、毛發散亂無光澤；對照組小鼠則一般情況正常。肝臟大體標本肉眼可見對照組小鼠肝臟呈粉、絳紅色，表面光滑。DDC模型組小鼠肝臟腫大，色澤黃變。肝臟HE染色后光鏡下顯示：對照組小鼠肝組織結構正常，膽管周圍無明顯炎性細胞浸潤，匯管區偶有散在炎性細胞浸潤；而DDC模型組小鼠匯管區以及膽管周圍可見大量炎性細胞浸潤，膽管內膽栓形成（圖1B）。小鼠匯管區炎癥分級DDC模型組為（2.9±0.6）；與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

三、2OA－BSA 模型小鼠

模型組小鼠隨著造模時間的延長，出現食欲減退、反應遲鈍、精神萎靡。毛發粗亂、部分脫毛、二目無神。正常對照組小鼠食欲正常、反應敏捷、毛色均勻烏黑、二目有神。肝臟大體標本肉眼觀：正常對照組小鼠肝臟呈粉紅色或絳紅色，表面光滑。2OA－BSA模型組小鼠肝臟腫大，色澤黃變，表面結構雜亂不規整。肝組織HE染色：模型組可見匯管區周圍和肝內小膽管周圍有大量炎性細胞浸潤（圖1C）；而對照組肝內膽管周圍及匯管區無或極少量炎性細胞浸潤。小鼠匯管區炎癥分級2OA－BSA模型組為（1.5±0.5）；與對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

四、dnTGF－βR II轉基因小鼠

轉基因組小鼠隨時間延長，出現食欲減退、腹瀉、體重下降、毛發粗亂、反應遲緩。野生型小鼠進食正常、反應敏捷、毛色烏亮，其肝臟外觀邊緣銳利，色澤紅潤。dnTGF－βR II組肝臟外觀腫脹，包膜緊張，邊緣鈍厚，色澤暗紅。肝臟常規病理HE染色比較：野生型小鼠肝細胞索以中央靜脈為中心向四周呈放射性排列，肝小葉結構清晰，肝細胞間聯系緊密；肝細胞核大而圓，核仁明顯，胞質豐富均勻；匯管區無炎性細胞浸潤，結構清晰可見。而dnTGF－βR II轉基因小鼠，可見匯管區和小膽管周圍淋巴、漿細胞浸潤，膽管上皮細胞變性壞死，基底膜不完整，小膽管增生（圖1D）。小鼠匯管區炎癥分級dnTGF－βR II轉基因組為（1.2±0.6）；與野生型對照組比較，差異有統計學意義（P＜0.01）。

本研究中的小鼠肝組織匯管區炎性細胞計數顯示：各對照組小鼠匯管區炎性細胞個數均很少，在0～3個之間（圖1E）。

圖1 各組小鼠肝組織光學顯微鏡下表現（HE，×200）

討 論

膽汁淤積是由于膽汁分泌及排泄障礙引起的一種病理生理過程，長期持續的膽汁淤積將進展為肝纖維化甚至肝硬化［6，7］。建立合適的膽汁淤積性肝病小鼠模型是研究膽汁淤積發生機制、篩選護肝藥物的前提，具有重要意義。盡管膽汁淤積造模方法較多，但不同物質或方法誘導膽汁淤積的機制不同，進而產生不同的病理和生化改變，各有利弊。

原發性硬化性膽管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）是一種慢性膽汁淤積性肝病，好發于青壯年男性，同時累及肝內、外膽管系統。病理特點為肝內大膽管呈節段性狹窄及擴張，導致不規則的膽管閉塞，形成多病灶膽管狹窄，最終可發展為肝硬化。本研究中的BDL和DDC小鼠模型即為以肝內大膽管損傷為特征的PSC動物模型。

BDL小鼠模型結扎小鼠膽總管后，隨時間延長肝臟對稱性腫大，出現膽汁淤積表現。本研究中采用膽總管結扎法造成小鼠肝外膽道梗阻，進而肝細胞缺血和壞死，建立膽汁淤積動物模型。此模型建立時間相對較短，術后10 d即可在光鏡下見輕度肝細胞腫脹、空泡變性，匯管區及大膽管周圍炎性細胞浸潤、膽管周圍纖維化?？紤]到手術應激、肝臟牽拉、甚至麻醉藥物的應用都會造成肝細胞損傷，因此在此組實驗設計中設置假手術對照組以觀察上述原因對肝組織的影響。光鏡下可見假手術對照組小鼠肝臟小葉結構清晰，肝細胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列，中央靜脈、匯管區動、靜脈和膽管結構正常。肝竇不擴張，肝組織匯管區和膽管周圍無或極少量炎性細胞浸潤。兩組小鼠匯管區炎癥分級差異有統計學意義。膽管梗阻時，肝臟實際上呈缺血狀態。毛細膽管進行性擴張，可形成小囊，微絨毛數量明顯減少或消失。肝細胞向肝血竇伸出微絨毛，阻塞血流。肝細胞和肝內巨噬細胞中出現膽色素顆粒沉積，肝內炎性單核吞噬細胞分泌Ly－6C和CD11b以及大量炎性因子［8］。膽管阻塞時，肝臟病理改變最明顯處為門管區，小葉間膽管增生，伴膽管周圍纖維化。增生膽管有很窄的管腔，不斷被膠原纖維包繞，最終導致肝硬化［9］。

已知外源物質和藥物可能導致膽管發生病理性改變，出現膽管纖維化。毒素可直接干擾肝細胞和/或膽管上皮細胞及其分子水平機制，通過影響相關基因（Ntcp，Oatp4，Mdr2，Mrp2，Mrp3，Mrp4等）表達的上調和/或下調、阻斷生長因子與受體結合、蛋白合成、炎性反應損害細胞膜和/或激活非實質細胞等起作用［10－14］。以往文獻顯示，喂養小鼠以 DDC后可使之膽卟啉分泌增加，誘導膽管上皮細胞表達血管細胞黏附分子、骨橋蛋白和腫瘤壞死因子α。同時，肝組織內CD11b陽性細胞、膽管損傷、膽管周圍成纖維細胞活化顯著增加并伴以嚴重的膽管周圍炎。隨著造模時間的延長，小鼠谷胱甘肽和磷脂的分泌顯著下降。出現膽管周圍炎、管周纖維化、相鄰門管區橋接樣炎癥，節段性膽管梗阻。本研究2周DDC小鼠造模組光鏡下肝細胞內可見膽色素沉積，膽管內膽汁淤積。上述結果表明，已成功建立DDC喂養誘導法的膽汁淤積性小鼠模型。

原發性膽汁性肝硬化是一種慢性膽汁淤積性肝病，中老年女性患者多見，血清堿性磷酸酶和γ－谷氨酰轉肽酶水平顯著升高，免疫球蛋白IgM升高。約90%～95%的PBC患者血清抗線粒體抗體（antimitochondria antibody，AMA）陽性，以免疫介導的肝內小葉間膽管炎損傷為病理學特征。PBC的病變特征即是肝內匯管區大量的淋巴細胞浸潤，自身反應性T細胞不斷破壞小膽管上皮細胞，導致膽管逐漸減少，膽汁淤積并最終引起進行性的肝臟損傷［15］。目前建立的PBC動物模型包括自發性模型、藥物誘導模型、抗原接種模型、細胞接種模型和基因缺陷模型［16－18］。

本研究中的2OA－BSA小鼠模型和dnTGFβR II轉基因小鼠均屬于以膽汁淤積為疾病特征的PBC動物模型。Wakabayashi等［5］在C57BL/6小鼠中以外源性物質2OA－BSA輔以完全弗氏佐劑腹腔內注射免疫造模并觀察至24周。該研究顯示，造模小鼠出現自身免疫性膽管炎、血清AMA陽性、肝組織內浸潤的淋巴細胞數量增加，后者尤指共表達CD44的CD8＋T細胞。血清腫瘤壞死因子α、干擾素γ等細胞因子增加。本研究中的2OA－BSA小鼠肝組織可見匯管區周圍和肝內小膽管周圍有大量炎性細胞浸潤；而對照組肝內膽管周圍及匯管區無或極少量炎性細胞浸潤。兩組小鼠匯管區炎癥分級差異有統計學意義。

顯性陰性轉移生長因子β受體II（dnTGFβR II）小鼠屬于基因缺陷PBC小鼠模型，其血清AMA陽性率100%［19］。本研究中觀察了dnTGFβR II轉基因及其野生對照型小鼠16周齡時肝臟病理組織學HE染色的變化。光鏡下觀察可見，野生對照組肝小葉完整，肝細胞排列整齊，未見明顯肝實質細胞病變，中央靜脈和匯管區結構正常。而dnTGFβR II轉基因組肝小葉輪廓不清，匯管區有大量淋巴、漿細胞浸潤，肝細胞腫大、胞質疏松，有的呈氣球樣變及嗜酸樣變，可見明顯點狀或灶性壞死（圖1D）。兩組小鼠匯管區炎癥分級差異有統計學意義。

已知TGF－β在細胞的增殖、分化、遷移過程中以及癌變、纖維化、創傷愈合、免疫反應中有重要作用［20－23］。同時，該細胞因子對 T、B、NK、巨噬細胞和樹突狀細胞有抑制作用。肝臟纖維化時，TGF－β起著重要作用。目前認為導致細胞外基質蛋白沉積增加的最主要細胞族是肝星形細胞（hepatic stellate cels，HSC），HSC通過旁分泌、自分泌途徑增加TGF－β生成。TGF－β繼而又參與HSC活化，導致細胞外基質蛋白生成增多、降解減少，發生肝纖維化［24］。dnTGF－βR II轉基因小鼠是由CD4啟動子控制的TGF－β受體Ⅱ顯性負相過度表達C57BL小鼠，因特異性損傷CD4啟動子處的TGF－βII型受體，導致其外周免疫耐受被影響。該小鼠能自發形成PBC，出現類似PBC患者的表現，包括：血清AMA/M2陽性，類似PBC肝臟病理及細胞因子譜的改變等。模型發病年齡為5～6周，組織病理顯示肝臟門脈區浸潤的炎性細胞和人類PBC非常相似。兩者均存在特異性的小膽管損傷、肝纖維化，肝臟浸潤的T細胞中CD4＋T細胞活化，活化CD4＋T細胞針對的靶抗原為丙酮酸脫氫酸復合體E2亞基，NKT細胞比例增加，血清免疫球蛋白水平上升，產生針對PDC－E2、2－酮戊二酸脫氫酶E2亞基和支鏈2－酮酸脫氫酶E2亞基的AMA，有ANA產生，以及血清IL－12、IL－6、腫瘤壞死因子α、干擾素γ等細胞因子增加［25］。TGF－β促進FoxP3＋調節性T細胞（Treg）的形成。有報道顯示PBC患者外周Treg水平降低［26，27］。TGF－β調節 Treg的 FoxP3表達，TGF－βII型受體受損，導致機體對肝臟自身蛋白免疫耐受的缺失，誘發自身免疫性疾病。上述模型的建立有助于闡明PBC發病機制，促進PBC早期診斷和治療研究的進一步深入。

膽汁淤積是多種肝臟疾病過程中常見的病理改變，表現為正常膽汁流被損害或阻斷，膽汁酸和其他有害物質過度蓄積而引發肝損傷。本研究所建立的四種膽汁淤積小鼠模型造模方法簡單、周期短，形成膽汁淤積穩定可靠。其中，BDL和DDC模型以大膽管損傷為主；2OA－BSA模型和dnTGF－βR II轉基因小鼠模型以小膽管損傷為主。實驗中均無對動物和人有毒物的物質接觸。因此，上述模型是研究膽汁淤積發病機制和尋找治療藥物研究的理想模型。

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