COX和CPT在非酒精性脂肪性肝病不同進展階段中的變化

劉曉琳 明雅南 張靜怡 曾民德 茅益民

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）包括單純性脂肪肝（NAFL）和非酒精性脂肪性肝炎（NASH），其與肥胖、糖尿病等代謝危險因素顯著相關。NAFLD已呈世界范圍內流行，各地患病率在6.3%～33%［1］。通常認為，NAFLD是一個良性過程，但是NASH具有進展為肝硬化和肝癌的風險［2］。

線粒體是細胞物質能量代謝的場所，通過多種信號通路參與肝臟的脂肪代謝和能量的產生。目前，已有越來越多的研究提示線粒體功能異常和NAFLD發生密切相關［3］，NAFLD已被認為是一種線粒體疾病。與NAFLD相關的線粒體異常包括線粒體呼吸鏈復合物活性降低和線粒體β氧化功能受損［4］。細胞色素C氧化酶（COX）是線粒體呼吸鏈電子傳遞的終末復合物，鑲嵌于線粒體內膜，可調控線粒體的氧化呼吸功能；而肉毒堿棕櫚酰轉移酶（CPT）是細胞線粒體脂肪酸氧化的限速酶，位于線粒體外膜，可調控長鏈脂肪酸由細胞質轉移到線粒體進行β氧化［5］。本研究旨在了解線粒體兩種關鍵酶在NAFLD進展中的變化。

資料和方法

一、材料

SD大鼠購于上海斯萊克動物實驗中心；高脂飼料和膽堿蛋氨酸缺乏飼料購于Research Diets公司（美國）；活性線粒體分離試劑盒（GMS10006.2）、純化線粒體細胞色素C氧化酶活性測定試劑盒（GMS10014.2）、純化線粒體肉毒堿棕櫚酰轉移酶活性測定試劑盒（GMS10104）購于杰美基因醫藥科技有限公司；Trizol、PrimeScriptTM反轉錄試劑盒、SYBR○RPremix Ex TaqTMII購于Takara公司（日本）；PCR引物購于上海生工有限公司；RIPA購于碧云天生物技術公司；BCA購于Thermo公司（美國）；COX和CPT抗體購于Abcam公司（英國）；全自動生化分析儀（SIEMENS ADVIA1800，美國）；TecanInfinite 2000多功能酶標儀（瑞士）；UV2450分光光度儀（日本島津）。

二、方法

（一）動物分組及模型制備 30只雄性6周齡SD大鼠平均分到3組，每組10只。在動物房適應性飼養1周后，對照組給予標準飼料，NALF組給予高脂飼料（HFD），NASH組給予蛋氨酸膽堿缺乏飼料（MCD）。期間自由飲水。飼養溫度控制在（24±2）℃，濕度為（50±5）%，每天換水和墊料，每周末稱重，持續12周。

（二）肝組織HE染色 在第12周末，大鼠處死后剪下整個肝臟并稱重，迅速切下一小部分放入4%甲醛溶液中過夜，第2天將固定好的肝臟組織修剪后放入石蠟中包埋，切片后使用自動染色機進行HE染色。

（三）血清指標檢測 在第12周末，采用眼底靜脈叢取血法采集30只大鼠的血液，4℃靜置凝固后，5 000×g離心30 min，隨后使用全自動生化檢測儀檢測大鼠血清ALT、AST、TBil、三酰甘油（TG）、總膽固醇（TC）、游離脂肪酸（FFA）、高密度脂蛋白（HDL）和低密度脂蛋白（LDL）。

（四）實時定量PCR檢測肝組織RNA 使用Trizol試劑盒提取肝臟總RNA，使用NanoDrop ND－1000檢測RNA的質量和純度，A260/A280≥1.8作為RNA質量合格的標準。根據PrimeScriptTM反轉錄試劑盒合成cDNA，然后按照SYBR○RPremix Ex TaqTMII說明擴增18S，COX和CPT。COX和CPT基因的mRNA水平以18S作為內參對照，結果表示為相對 mRNA含量。所用的引物序列為：COX：TGTTCTTCATCGGCTTCACT，AGGGAGGGAGGGAGGAG；CPT：TGACCCTACTACATCCAGAGAT，TCAGACGCCCAAGTATTCAC；18S：AGTCGCCGTGCCTACCAT，CGGGTCGGGAGTGGGTAAT。

（五）Western印跡檢測肝組織蛋白 肝組織蛋白用RIPA試劑盒提取，并用BCA法測定肝臟蛋白濃度。經10%SDS－PAGE電泳分離；轉移至硝酸纖維素膜，轉膜電流為300 mA，COX為8 min，CPT為40 min；在5%的脫脂牛奶室溫封閉1 h后，與兔抗鼠的COX（1∶1 000）、CPT（1∶2 000）抗體孵育，4℃過夜。第2天用TBST洗膜3次。室溫孵育二抗3 h，洗膜2次。使用熒光試劑盒發光顯影。

（六）提取線粒體 肝臟線粒體的提取使用GENMED活性線粒體分離試劑盒。取新鮮肝組織加入預冷的裂解工作液5 mL，渦旋5 s后放入預冷的DOUNCE勻漿器，勻化組織80下，4℃1500×g離心10 min，移出上清液到另一離心管，10 000×g離心10 min，棄上清液，加入保存液2 mL，10 000×g離心5 min，棄上清液，加入凍存液1 mL，混勻后放－80℃冰箱保存。

（七）線粒體COX和CPT活性的檢測 使用Bradford蛋白定量測定每份線粒體樣品的蛋白濃度。線粒體COX活性的檢測使用GENMED純化線粒體細胞色素C氧化酶活性測定試劑盒（GMS10014.2）：在445μL的緩沖液中加入5μL待測樣品，室溫孵育3 min，加入50μL含有反應液和穩定液的反應工作液，即刻放進分光光度儀，波長550 nm，在0s和60 s各測讀1次。線粒體CPT活性的檢測使用純化線粒體肉毒堿棕櫚酰轉移酶活性測定試劑盒：在350μL的緩沖液中加入50μL反應液和50μL底物液，室溫孵育3 min，加入50μL待測樣品，即刻放進分光光度儀，波長為412 nm，在0min和15 min各測讀1次。

三、統計分析

統計 使 用 SPSS16.0，作 圖 使 用 GraphPad Prism5.0。計量資料采用均值±標準差表示，組間比較使用單因素方差分析和Newman－Keuls檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、動物模型的建立

在造模過程中，NAFL組大鼠的體質量逐漸升高，且高于對照組，而NASH組大鼠的體質量自第5周開始逐漸低于對照組。造模結束后，NAFL的體質量高于對照組，而NASH組體質量低于對照組（P＜0.05）。NAFL和NASH組的肝指數（肝濕重/體質量）都明顯高于對照組，且NASH組顯著高于NAFL組（P＜0.05）。表1。

表1 各組大鼠體質量、肝濕重和肝指數比較（s）

表1 各組大鼠體質量、肝濕重和肝指數比較（s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與 NAFL組比較，b P＜0.05

組別 鼠數 體質量（g）肝濕重（g）肝指數（%）06 NAFL組 10 681.00±28.47 20.26±1.14a2.98±0.12 NASH 組 10 313.70±9.22 16.52±9.22a5.28±0.19對照組 10 545.80±12.86 41.01±0.35 2.57±0.ab

二、各組大鼠肝臟病理組織學改變

對照組大鼠的肝臟組織結構完整，肝板排列整齊，肝細胞形態結構正常；NAFL組大鼠的肝臟出現大泡和小泡性脂肪變以及氣球樣變，主要集中在3區，且有少量炎性細胞浸潤；NASH組大鼠肝臟則呈現明顯的大泡性脂肪變，范圍波及整個肝葉，炎性細胞浸潤明顯，且存在點狀壞死。由此提示，NASH組大鼠的肝臟組織學進展程度更重，脂肪變、氣球樣變、小葉炎性反應更明顯。見圖1。

三、各組大鼠血清各項指標的變化

與對照組相比，ALT和AST在NAFL組和NASH組均明顯升高，NASH組顯著高于NAFL組。NASH組的TBil和LDL均較對照組和NAFL組顯著增高。TG在NAFL和NASH組中升高。見表2。

四、各組大鼠肝臟組織COX和CPT基因表達量的變化

在大鼠的肝臟組織中提取RNA和蛋白檢測了COX和CPT表達量的變化。RT－PCR結果顯示，與對照組相比，NAFL組和NASH組COX mRNA含量均降低（P＜0.05），見圖2A；NAFL組和 NASH 組CPT mRNA含量分別降低了50%和60%（P＜0.05），見圖2B。NAFL組和 NASH 組的 COX和CPT的蛋白含量也明顯降低。見圖2C。

五、各組大鼠肝臟組織線粒體COX和CPT酶活性的變化

從肝臟組織分離的活性線粒體立即測量了COX和CPT兩種酶的活性，結果顯示：COX在NAFL和NASH組，分別降低20%和35%，且NASH組低于NAFL組（P＜0.05）；CPT在 NAFL和 NASH 組，分別降低35%和50%，且NASH組低于NAFL組（P＜0.05）。結果表明，COX和CPT兩種酶在NAFLD中活性都受到抑制，且隨著疾病的進展，兩種酶的活性降低更為顯著。見圖3。

表2 各組大鼠血清各指標比較（s）

表2 各組大鼠血清各指標比較（s）

注：與對照組比較，aP＜0.05；與 NAFL組比較，b P＜0.05

組別 鼠數 ALT（U/L）AST（U/L）TBil（μmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）HDL（mmol/L）LDL（mmol/L）01 NAFL組 10 147.90±32.75a190.30±22.48a2.25±0.14 1.92±0.07 1.35±0.20a 0.40±0.01 0.38±0.20 NASH 組 10 422.90±63.58ab 587.90±66.00ab 6.24±0.44ab 2.09±0.27 1.70±0.24a 0.35±0.05 0.78±0.17對照組 10 42.30±2.53 107.70±3.50 2.18±0.17 1.74±0.16 0.80±0.06 0.37±0.02 0.13±0.ab

圖1 各組大鼠的肝組織病理切片（HE×200）

圖2 COX和CPT在不同組別大鼠肝臟的表達情況

圖3 COX和CPT在大鼠肝臟線粒體中的活性水平

討 論

NAFLD的發病機制尚未完全闡明，游離脂肪酸向肝臟的傳遞和運輸增多、脂肪酸氧化能力下降可能是NAFLD發病中的關鍵環節［6］。線粒體通過不同信號通路的調控，不僅參與脂肪酸的β氧化，而且在細胞能量代謝中也發揮重要作用。越來越多的研究證實肝臟的線粒體在NAFLD的發生發展中起到重要作用，但是具體的分子機制尚未明確［7］。

在NAFLD中，線粒體氧化呼吸鏈（MRC）復合物的活性發生了改變。在HFD和MCD誘導的NASH動物 模 型 中，COX 活 性顯著下 降［8－9］，但 也 有 報 道，COX活性不變甚至升高［10］，這可能提示在NAFLD的進展中有一些MRC水平的代償機制被激活。一項研究探索了NASH患者中MRC復合物活性的改變，發現5種MRC復合物的肝臟活性明顯降低，且與血清TNF－α水平有關［11］。在 NAFLD中，飽和脂肪酸可直接抑制與 MRC相關的酶［12］，也可激活c－Jun氨基端激酶，引起線粒體膜通透性轉換，導致線粒體釋放細胞色素C發生凋亡；同時過量產生的活性氧自由基可以對MRC復合物造成損傷［13］。本研究發現，在NAFL和NASH大鼠模型中，肝臟的COX mRNA和蛋白水平都下降，尤其在肝臟純化的線粒體中，COX的活性在NASH大鼠比NAFL大鼠降低的程度更顯著。提示在分離的線粒體中檢測酶的活性改變能更敏感的反映肝臟線粒體的功能障礙；同時也提示隨著NAFLD的進展，肝臟的能量代謝狀態逐漸惡化。

有研究報道，在嚙齒類動物NAFLD的模型中線粒體的脂肪酸氧化水平降低，同時與之相關的酶如CPT的活性降低［14－15］。隨著高脂飲食時間的延長，PPARα表達逐漸降低，肝臟損傷加重［16］。特別是在NASH的動物模型中，PPARα表達量持續下降，脂聯素水平逐漸降低［17］。雖然在NAFLD中線粒體脂肪酸氧化可維持正常或增強，但在一些以廣泛氧化應激和脂質過氧化為特征的嚴重NASH和肝硬化階段，線粒體的脂肪酸β氧化過程減弱［18－20］。這些數據都證實了NASH的線粒體β氧化功能存在不同程度的受損。而在本研究中NAFL和NASH大鼠肝臟CPT基因的表達量都減少，并且在肝臟純化的線粒體中測量CPT的活性，發現在NAFL組和NASH組中，該酶的活性都受到了明顯抑制，且NASH組比NAFL組的降低程度更顯著。提示在NAFLD進程中，線粒體脂肪酸氧化過程受損，且NASH比NAFL的損傷程度更重。

綜上，在NAFLD中，線粒體的能量轉化和物質代謝功能都受到了不同程度的抑制，脂肪酸氧化功能異常會促進肝臟的脂肪聚集，MRC功能的進行性降低會干擾能量的輸出。隨著疾病的發展，兩者的惡化會逐漸導致活性氧的過量產生，從而加重氧化應激，促發惡性循環進一步加重NAFLD。線粒體是多種物質和能量的代謝場所，所以其功能障礙會留下代謝指紋，未來可以通過代謝組學等高通量技術篩選出特異性的線粒體障礙標志物，這將有利于在NAFLD患者中早期發現線粒體功能異常。

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