攜載紫杉醇的納米粒子靶向治療腦膠質瘤的研究進展①

李明軍,榮向輝,李英夫,呂霽

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

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攜載紫杉醇的納米粒子靶向治療腦膠質瘤的研究進展①

李明軍,榮向輝,李英夫,呂霽

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

神經膠質瘤；紫杉醇；血腦屏障；多功能納米粒子；靶向

腫瘤是嚴重威脅人類生命健康的重大疾病之一，我國腫瘤最新發病率已達千分之二，死亡率為千分之一點五。腦神經膠質瘤是發病率最高的腦腫瘤,也是死亡率最高的十大腫瘤之一，以及腦膠質瘤瘤體細胞呈浸潤性生長的特點,使得目前治療腦膠質瘤的主要手段是手術切除配合放、化療,但是均很難以達到良好的治療目的[1，2]，這是腦神經膠質腫瘤治療的最大障礙。而且神經膠質瘤腫瘤組織的微環境與正常組織存在顯著的差別，血腦屏障(BBB)的存在不利于藥物通過血管輸送到腫瘤組織的深部及細胞內藥物作用的靶位。惡性腦膠質瘤患者術后中位生存期很短，尚不足兩年。因此如何選擇合適的抗腫瘤藥物，可通過BBB、靶向腫瘤微環境、提高藥物對腫瘤組織的選擇性和滲透性并能跨膜輸送至細胞內達到有效濃度已經成為腦腫瘤治療的新挑戰。

紫杉醇(Paclitaxel, 簡稱PTX)是從短葉紅豆杉(Taxusbrevifolia)中提取的雙萜類天然產物又經化學修飾合成, 為一類新型抗腫瘤藥物[3]，其作用機理以穩定微管并防止微管解聚及調節信號傳導，從而使腫瘤細胞無法有效分裂而死亡。然而, 由于紫杉醇資源匱乏,水溶性低,難以通過血腦屏障等, 使其在臨床上在腦部腫瘤，特別是神經膠質瘤的應用治療受到很大程度的限制[4]。因此，研發新型紫杉醇載藥體系和劑型及研究其抗腫瘤活性，靶向作用于腦部腫瘤，對于臨床治療腦神經膠質瘤用藥具有非常重要的意義[5]。

1 國內外研究現狀分析

由于血腦屏障的存在，使紫杉醇等抗腫瘤藥物不能在腦內富集發揮藥效，限制了紫杉醇在腦部腫瘤治療中的應用，而且腫瘤組織的微環境與正常組織存在顯著的差別，不利于藥物通過血管輸送到腫瘤組織的深部及細胞內藥物作用的靶位。應用納米載藥系統解決抗腫瘤藥物透過血腦屏障、實現藥物在腦內的富集腦靶向問題吸引了廣大科研人員注意力。利用納米微粒作為小分子抗腫瘤藥物靶向傳遞系統的研究正在快速的發展和進行中。這種納米載藥系統不僅能夠改善療效、提高抗腫瘤藥物的生物利用率、減少臨床用藥量、減輕或消除毒副作用，還具有藥物釋放的可控性和腫瘤靶向定位的優點。因此，腫瘤的靶向治療應運而生并且迅速成為研究的熱點。

1.1 多功能串聯肽裝飾的紫杉醇脂質體

由于血-腦屏障(BBB)的原因，神經膠質瘤的藥物治療存在極大的挑戰。為了使藥物能特異性地積聚在腦膠質瘤病灶和進入大腦后滲透到腫瘤核心，降低對正常腦組織毒性，實現有效的治療。LiuY等人在這項研究中，將一個特定的環狀配位體RGD肽綴合至于細胞穿透肽R8上開發一種多功能肽R8-RGD。與單獨R8和RGDR相比較，分別與顯示的三維膠質瘤球體和血腦屏障模型體外實驗有效穿透性，8-RGD擁有通過2～30倍的增加脂質體的細胞攝取量。C6膠質瘤荷瘤小鼠體內研究表明，R8-RGD-脂全身給藥后可以有效地輸送到大腦和選擇性累積在膠質瘤灶。當在脂質體載紫杉醇(PTX)，R8-RGD-脂可對C6細胞細胞凋亡引起強烈的抑制，在顱內膠質瘤荷瘤小鼠獲得的最長存活時間。最后，所有的結果表明，在串聯肽R8-RGD是一個有希望的具有多功能配位體，包括血腦屏障輸送，神經膠質瘤靶向和腫瘤穿透性。R8-RGD-脂被證明是一個潛在的抗神經膠質瘤的藥物遞送系統[6]。

1.2 裝飾EGFP-EGF1(ENP)納米顆粒靶向腦膠質瘤的新生血管和膠質瘤治療

新生血管和神經膠質瘤細胞具密切相關性，可能是相互促進神經膠質瘤生長，針對這兩個方向我們研究，與那些針對其中的一個方向的相比較，我們發現針對新生血管和神經膠質瘤細胞雙靶向策略是更有前途的。在我們報道的藥物遞送系統，其中納米顆粒被飾以EGFP-EGF1(ENP)，來自于在神經膠質瘤組織中VII因子與組織因子(TF)融合蛋白的的特殊親合力的過表達的研究。通過針對新生血管和神經膠質瘤細胞這兩個方面的研究，體外蛋白質結合測定法表明：EGFP-EGF1作用至C6細胞和人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)形成的人工血管模型EGFP-EGF1-TF的相互作用顯著增強納米顆粒攝取、HUVEC和神經膠質瘤C6細胞以及C6膠質瘤球狀納米顆粒的滲透，并由此，它們有效通過兩個單層細胞層和提高了對神經膠質瘤細胞毒性作用。在神經膠質瘤的小鼠的體內成像證實ENP在膠質瘤組織中特異性蓄積。納米顆粒體內分布直觀地表明ENP主要作用于兩個血管外的神經膠質瘤細胞和新生血管細胞。藥效學結果表明，與其他組進行比較，加載ENP的PTX(ENP-PTX)顯著延長神經膠質瘤小鼠的平均存活時間。與其他治療方法相比，TUNEL法和HE染色顯示ENP-PTX治療引起的顯著腫瘤細胞凋亡，腫瘤壞死。總之，結果證明EGFP-EGF1功能化納米粒子對腦膠質瘤雙靶向的治療具有巨大發展潛力[7]。

1.3uPA激活細胞穿透肽(ACPP)的多靶向性藥物傳遞系統

經過研究，現在大家都明白腫瘤的生長是多途徑的綜合結果，神經膠質瘤實質細胞和間質細胞是密切相關的，相互代償的。因此，針對他們兩者的給藥策略，可能獲得更多有前途的治療效果。ZhangB,等在研究中，開發了用于治療腦膠質瘤(ANP)的改性的uPA激活細胞穿透肽(ACPP)的多靶向性藥物傳遞系統。體外實驗證明，與傳統相比飾有細胞穿透肽(CPP)或ACPP納米粒子能顯著提高C6膠質瘤細胞的吸收球狀納米顆粒(NP和納米粒子滲透到神經膠質瘤)的能力，在活體動物實驗表明，ANP腦膠質瘤的細胞內積累比NP裝飾帶或不帶CPP了更具體。ACPP促成膠質瘤細胞內納米顆粒積累，ANP不僅能夠定位于膠質瘤薄壁細胞，也可與基質細胞，包括新血管細胞和腫瘤相關巨噬細胞。證明ACPP藥效學結果由納米顆粒顯著延長荷瘤小鼠的存活時間，可顯著改治療效果。結果表明，納米改性的uPA敏感ACPP可達到多種類型的細胞組織，并提供一種新的膠質瘤靶向治療策略[8]。

1.4 裝載紫杉醇腦靶向的轉鐵蛋白結合的聚磷酸酯混合膠束

由于藥物穿過血-腦屏障(BBB)的低效價，藥物輸送受到阻礙，藥物治療中樞神經系統(CNS)腫瘤疾病的治療受到限制。轉鐵蛋白(TF)可以促進納米載體通過鐵蛋白受體(TFR)介導的途徑轉運作用。在這項研究中，TF-改性裝載紫杉醇聚磷酸酯混合膠粒(TPM)，制備并評價聚磷酸酯的混合膠束形成的核-殼結構其在體外和體內腦靶向的效率。在水溶液中，其表現出高的藥物截留效率(89.9 ±3.4)%此外，膠束顯示的溶血在2.0mg/mL可忽略不計。該TPM是(87.85±2.32)nm的電勢-12.33±1.46mV和聽PTX聽呈持續釋放TPM，TPM證實細胞攝取和腦積累增強。2和1.8倍PMT，PM表現最強的抗膠質瘤活性，意味著小鼠顱內U-87MG聽神經膠質瘤與TPM(39.5d)治療的生存期顯著長于單純紫杉醇(33.6d)處理。這些結果表明，與鐵蛋白綴合的膠束可以是一個有希望用于腦靶向藥物遞送的載體[9]。

1.5 載有阿霉素和紫杉醇的轉鐵蛋白結合的磁性二氧化硅納米粒子的PLGA

有效治療惡性腦膠質瘤的藥物由穿過血 - 腦屏障(BBB)并穿過血液 - 腫瘤屏障(BTB)的低滲透差輸送而受到阻礙。在這項研究中，轉鐵蛋白綴合的磁性二氧化硅的PLGA納米顆粒(MNP-MSN-PLGA-鐵蛋白納米粒)配制來克服這些障礙。這些納米顆粒裝載有阿霉素(DOX)和紫杉醇(PTX)，在體外和體內進行它們的抗增殖作用評價。在體外細胞毒性的實驗中，載藥納米顆粒作用U- 87細胞進行評價。通過磁場的存在和TF的使用，載藥納米顆粒隨細胞的攝取可以分別增強靶向配體，特別是，含DOX的PTX-NPS-Tf中，含DOX的PTX納米粒，含DOX的PTX-NPS-TF和自由鐵蛋白的治療。含DOX的PTX-NPS-TF和相比磁場處理的細胞表現出最高的細胞毒性;載藥納米顆粒的體內治療效果進行了評價，在BALB/c裸鼠的顱內種植U-87MG-luc2進行造模，實施動物實驗。相比含DOX的PTX-NPS-鐵蛋白治療表現最強的抗神經膠質瘤活性，PTX-NPS-Tf中，含DOX的NPS-鐵蛋白空白MNP-MSN-PLGA-鐵蛋白納米粒應用后并沒有表現出急性毒性。總體而言，MNP-MSN-PLGA-鐵蛋白納米粒是有希望應用于實踐，雙重藥物有效治療腦膠質瘤的合適載體[10]。

1.6 聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-CO-PEG嵌段共聚物納米顆粒

紫杉醇納米粒子穿透血腦屏障可改善惡性膠質瘤治療。在大多數癌癥，包括原發性腦腫瘤，由于腫瘤內藥物分布差和藥物短的半衰期強烈限制化療藥療效。對于不能完全手術切除的神經膠質瘤，通過控制聚合物局部的釋放或靶向藥物遞送是一種很有前途的方法來治療浸潤腦腫瘤。然而，藥物滲透與傳統療法局部有限的，因為小分子藥物往往進入他們遇到的最近的組織細胞，且其滲透作用只持續很短的距離。納米顆?？梢员苊馀c腫瘤細胞外基質粘附相互作用可以提高藥物分布和當作用到腫瘤區域維持廣泛的藥物釋放。我們以前曾研究表明當涂覆有異常致密層的聚(乙二醇)(PEG)，當納米顆粒直徑達114納米時，聚苯乙烯納米顆粒模型能夠在正常的腦組織中迅速擴散，可以減少粘合劑的相互作用。這里，NanceE等人研究表明，攜載紫杉醇(PTX)平均直徑為70nm的聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)-CO-PEG嵌段共聚物納米顆粒比類似尺寸的攜載PTXPLGA顆粒(不含PEG)或未包封的PTX相比能夠有100倍的擴散速度，PEG化的加載PTX納米粒局部應用到既定腦膠質瘤時能顯著延遲腫瘤生長。結合載藥PLGA-PEG納米粒子增強分布于腫瘤浸潤面，延緩腫瘤生長，證明了腦腫瘤實質內納米粒子穿透力提高了，同時提高治療效果。使用載藥腦穿透納米顆粒是一種很有前途的方法來實現持續的和更均勻的藥物輸送到治療侵襲性膠質瘤和潛在的其他腦部疾病。

現在用于納米藥物載體的材料主要是殼聚糖(CS)和磷脂(PE)的聚合物。殼聚糖具有生物降解性、生物相容性、生物粘附性和促滲透作用，對人體幾乎無毒副作用，已被廣泛應用于醫學領域。此外，由于殼聚糖分子上具有活性氨基和羥基，為接枝反應和離子相互作用提供了基礎，因此適合作為藥物控釋系統的載體材料 。磷脂酰乙醇胺在動物中是通過胞苷二磷酸乙醇胺和1，2-甘油二酯的反應生成的，經磷酯酶A的作用生成溶血磷脂酰乙醇胺。聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺納米膠束粒徑小、尺寸均一，作為藥物載體近年來也受到關注, 但其昂貴的價格使它的實際應用受到限制。開發一種價格便宜、制備方法簡單的載體，為臨床應用提供新的載體材料成為研究的重點。

納米藥物載體還可以根據腫瘤細胞表面的受體連接相應的化合物，使其具有對腫瘤的主動靶向作用。研究證實在納米粒子表面連接乳鐵蛋白(Lf)、轉鐵蛋白(Tf)和Angiopep肽、uPA激活細胞穿透肽(ACPP)等均能提高納米粒通過血腦屏障的能力，有較顯著的腦腫瘤靶向作用。此外，納米載藥系統還能夠進行熒光標記。貴金屬納米團簇是新近發現的適合納米粒子的熒光標記物，是由Au、Ag或Pt等貴金屬的幾個至幾十個原子組成的具有熒光水溶性的分子級聚集體，其特有的量子尺寸效應使其熒光發射光譜在可見光到近紅外光區范圍內可調諧。此外，貴金屬納米團簇具有生物相容性好、光穩定性強且在所有相關時間尺度上無閃爍等特點，顯著提高現有分析方法的靈敏度。

大量的研究已經證實納米材料作為有效載體能夠透過血腦屏障，其機制可能有以下幾方面：①通過在腦微血管壁上的長時間吸附，延長了抗腫瘤藥物在腦微血管處的作用時間；②其特定表面活性效應致使腦血管內皮細胞膜的脂質溶解度、細胞膜流動性增強了；③開放血管內皮細胞間的緊密連接；④能夠以胞飲的方式被血管內皮細胞吞噬；⑤能夠直接穿越透過血管內皮細胞層而進入腦組織；⑥表面修飾劑T-80抑制P-糖蛋白的作用。這些機制可能單獨或聯合發揮作用。基于納米材料的這些優勢，現在人們開始重視通過納米技術構建載藥系統，將化療藥物或基因靶向到腦腫瘤，進而達到有效治療腫瘤的目的。

2 展望

目前，運用納米技術包載紫杉醇的納米載藥系統的構建技術已經成熟。我們前期研究工作已經可以通過乳化溶劑蒸發技術包載紫杉醇得到大小均勻的載藥納米粒子。盡管腫瘤靶向治療的納米載體近年來經歷了爆發式的發展，迄今為止只有少數的幾種納米載體藥物能夠通過FDA的批準進入市場，因為這些納米載體或多或少在潛在毒性、生物相容性、體內穩定性以及載藥能力等方面存在著嚴重的缺陷和挑戰。納米載體攜載紫衫醇進入腦內對中樞神經系統的作用機制如何，是否發生與外周神經相同的作用？作用機制如何？這都有待于我們去解決。但我們還要在下面兩個方面進一步研究，一、如何將靶向配體、磷脂和熒光標記的納米金簇結合，實現靶向腦腫瘤和靶向腫瘤微環境，又具有生物檢測的特點，降低生產成本，從而構建一種更適合攜載紫杉醇的多功能納米載藥系統；二、從分子、細胞和動物水平深入研究其對海馬神經元的毒性，利用基因芯片、2-DE等組學技術尋找與紫杉醇相互作用的關鍵靶蛋白，確定其結構，運用結構生物信息學技術分析其作用網絡，推測出紫杉醇調控海馬神經元的分子機制，并將關鍵靶蛋白克隆并轉染至海馬神經元加以驗證。為臨床應用紫杉醇多功能納米粒子治療腦膠質瘤時，合理用藥、降低毒副作用提供理論依據；為設計合成高效、多功能納米藥物提供理論支持和新的思路，同時我們還將為研發具有自主知識產權的新型納米藥物提供新的載體材料。

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李明軍(1965～)男 ，黑龍江鶴崗人，學士，主任醫師，碩士研究生導師。

榮向輝(1976～)男 ，黑龍江佳木斯人，在讀碩士研究生，副主任醫師。E-mail：171167108@qq.com。

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