一個常染色體顯性遺傳性先天性白內障家系分析①

王海峰，張 娜，王遵敬

(1.林口縣人民醫院眼科,黑龍江 林口 157600；2.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院眼科，黑龍江 哈爾濱 150007；3、牡丹江市第二人民醫院眼科，黑龍江 牡丹江 157000)

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一個常染色體顯性遺傳性先天性白內障家系分析①

目的：對1個常染色體顯性遺傳性先天性白內障家系進行基因突變熱點的篩查，以探索其潛在的遺傳學缺陷。方法：經過詳細的病史采集及完善的眼科學檢查后，對1個家系共10名成員(包括患者，非患者)抽取外周血提取基因組DNA，針對國內外文獻報道的與常染色體顯性遺傳先天性白內障發病相關的10個基因設計引物，PCR擴增后直接測序進行候選基因的突變檢測。結果：被檢查者的10個發病相關基因序列中，CRYBA4基因第四個外顯子上c.281T>C突變，并由此導致了βA4晶狀體蛋白第94位的苯丙氨酸被絲氨酸取代，其余9個與GenBank發表的正常序列相同。結論：CRYBA4基因外顯子上發現的已經報道過的雜合型突變位點，可能是這個家系的致病基因，其對先天性白內障的作用需進一步研究。

先天性白內障；常染色體顯性遺傳；基因突變；序列分析

先天性白內障是由于晶狀體在胚胎發育過程中代謝異常而導致透明度下降的疾病，是一種嚴重的致盲性晶狀體疾病。遺傳性先天性白內障可以只表現為晶狀體的單一混濁，也可伴發眼部及其他系統的先天性異常。其遺傳方式有三種，既常染色體顯性、常染色體隱性及X連鎖隱性遺傳，其中以常染色體顯性先天性白內障最為常見。研究顯示任何參與、影響晶狀體發育的基因突變都可能導致先天性白內障的發生。目前約有60個致病位點被證明與先天性白內障有關，有20多個基因檢測到了與先天性白內障相關的突變，突變導致晶狀體結構和代謝的異常，從而誘發白內障的發生。這些基因包括晶狀體蛋白基因(主要包括α-晶體蛋白，β-晶體蛋白和γ-晶體蛋白，此外還有含量很少的ζ和μ晶狀體蛋白)、膜蛋白基因(主要包括縫隙連接通道蛋白GJA3和GJA8和主要內源性蛋白MIP)、細胞骨架蛋白基因、轉錄調節因子基因(包括HSF4，MAF，PAX6 等)等。目前白內障的發病機制尚未清楚，對其致病基因進行篩查是探索先天性白內障發病內在機制的重要手段。

1 資料與方法

1.1 一般資料

研究對象為在哈爾濱醫科大學附屬第二臨床醫學院眼科確診的一個3代常染色體顯性遺傳先天性白內障家系，共有成員10名，其中先天性白內障患者3名，非白內障患者5名，未確診患者2名。除了未確診患者其余所有的入選人員均在哈爾濱醫科大學附屬第二臨床醫學院接受全身及眼部檢查。

1.2 方法

對5名家系成員(患者3名，非患者2名)常規抽取外周血5ml,EDTA抗凝，用北京天根生物科技公司的血液基因組提取試劑盒提取基因組DNA，稀釋至工作濃度后置于-20°C保存備用。

根據Genbank中的10個基因的序列，應用PRIMER6.0設計引物，通過上海生工生物公司合成，以基因組DNA為模板，通過PCR反應對目的片段進行擴增。使用Chromas查看測序峰圖，用LasergeneSeqMan及BLAST在線網站將擴增片段的測序結果與在線的數據庫中正常的序列比對。對異常的測序峰圖( 例如堿基的突變、缺失、插入等)進行重復實驗并且雙向測序驗證結果。

1.3 臨床表現

3代共10人，包括男4人，女6人，為典型的常染色體顯性遺傳。參與此次研究的家系成員抽取血樣5份，其中患者3份，正常成員2份。患病成員均為出生后即存在的雙眼晶狀體混濁，影響視功能，隨年齡增長視力下降漸重。臨床檢查為核型白內障。無其他眼部疾病及全身性疾病史。(見圖1)

圖1

1.4 序列分析

家系中3名患者CRYBA4基因的4號外顯子第281位發生了T→C的突變，從而導致了有CRYBA4編碼的蛋白第94位苯丙氨酸被絲氨酸所取代。該位點被polyphen2在線軟件預測為“possiblydamaging”，因此c.225G>T也可能具有一定的致病性(圖2)通過NCBIhomogene數據庫比對CRYBA4基因同源蛋白的氨基酸序列，我們發現CRYBA4基因第94個氨基酸 苯丙氨酸為高度保守的氨基酸序列，具體的比對見圖3。

圖2

圖3

2 討論

晶體蛋白是晶狀體中含量最豐富的結構蛋白，占晶狀體內溶解性蛋白質的90%，是纖維細胞失去細胞核后，合成的穩定的非再生的高濃度的晶狀體蛋白，介導了晶狀體高折射率，對晶狀體的透明性和屈光性起重要的作用。因此任何能改變蛋白質空間構象，改變蛋白溶解度，使可溶性蛋白質沉淀、析出均能介導白內障的發生。通過對該先天性白內障家系CRYBA4基因的篩查，我們檢測到該家系兩名患者的DNA中，位于CRYBA4基因外顯子上c.281T>C的突變，并由此導致了βA4晶狀體蛋白第94位的苯丙氨酸被絲氨酸取代，而在家系中其他正常成員和100名正常對照者的CRYBA4基因中并未發現該突變。從而，我們推測，位于CRYBA4第四外顯子上的c.281T>C突變與這個家系的患病有關。苯丙氨酸具有疏水性，但是絲氨酸具有親水性，此外苯丙氨酸屬于芳香族氨基酸，但是絲氨酸則是脂肪族氨基酸，因此二者的結構和功能具有重大的差異。極性氨基酸絲氨酸，具有很強的親水性，易與周邊氨基酸形成大量的氫鍵，因而具有很強的綁定功能。因此絲氨酸代替苯丙氨酸后，能和磷酸骨架或周圍的氨基酸形成較多的氫鍵，影響蛋白的穩定性或減少了與其他蛋白質的結合。這可能預示著該段區域的堿基改變在先天性白內障的發病中起著重要作用。該家系患者第281位堿基C取代了T，導致CRYBA4蛋白第94位的苯丙氨酸被絲氨酸所取代。上述氨基酸的改變會使蛋白質的正常的二級結構發生，破壞了該蛋白的穩定性。由于晶體蛋白之間的相互作用，β-A4晶狀體蛋白的異常，也會導致其他蛋白的表達發生變化，這一系列的異變發生在晶狀體的發育過程中，最終不能形成正常規則排列的透明晶狀體，可能引起白內障的發生。該突變位點在白內障星晨個中作用需要進一步的動物實驗予以證實。

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The analysis of mutations in an Chinese family with congenital cataract

WANGHai-feng1,ZHANGNa2,WANGZun-jing3

(1. Ophthalmology Department, People’s Hospital in Linkou County, Linkou 157600, China; 2. Ophthalmology Department, the Second Affiliated Hospital of Haerbin Medical University, Haerbin 150007,China; 3. Ophthalmology Department, the Second People’s Hospital in Mudanjiang City, Mudanjiang 157000, China)

Objective: To identify mutations in an Chinese family with congenital cataract .Methods: Venous blood was collected from family members to extract DNA.Ten different genes were identified as the cause of autosomal congenital nuclear cataract,which were screened by PCR amplification and sequencing.Results: We identified a c.281T>C sequence change which led to an amino acid substitutions in the CRYBA4 induced protein in the three patients of this family, and did not detect in the other individuals.Conclusion: One mutation iss discovered, while further study is required to determine the effect of congenial cataract.

congrnital cataract;mutataion;sequence analysis

王海峰(1973～)男，黑龍江林口人，本科，副主任醫師。

王海峰1，張 娜2，王遵敬3

(1.林口縣人民醫院眼科,黑龍江 林口 157600；2.哈爾濱醫科大學附屬第二醫院眼科，黑龍江 哈爾濱 150007；3、牡丹江市第二人民醫院眼科，黑龍江 牡丹江 157000)

R

B

1008-0104(2015)03-0153-02

2014-12-20)