基質金屬蛋白酶-14(MMP-14)在膽脂瘤型中耳炎中的表達及意義①

張愛華，周一莎

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

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基質金屬蛋白酶-14(MMP-14)在膽脂瘤型中耳炎中的表達及意義①

張愛華，周一莎

(佳木斯大學附屬第一醫院,黑龍江 佳木斯 154003)

目的:研究基質金屬蛋白酶-14(matrix metalloproteinase-14， MMP-14)在膽脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的表達特點及意義，并探討 MMP-14對膽脂瘤型中耳炎侵襲能力的影響。方法:采用免疫組織化學染色法(SP法)檢測MMP-14膽脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的表達。結果:31例膽脂瘤型中耳炎上皮中MMP-14的陽性表達明顯高于正常外耳道上皮中的陽性表達。其中膽脂瘤上皮表達的染色結果表現最強，多在中至強陽性，其余上皮組織中各層細胞均有不同表達，基底膜染色強。結論:MMP-14可能在膽脂瘤型中耳炎上皮的增值與骨破壞中起重要作用。

膽脂瘤；中耳炎；基質金屬蛋白酶類

膽脂瘤型中耳炎(cholesteatoma of middle ear)是耳鼻咽喉科常見的疾病，是一種位于中耳乳突腔內的囊性結構，而非真性腫瘤，臨床發現，膽脂瘤型中耳炎具有類似于惡性腫瘤的生物學特征，如破壞性、侵襲性、遷移性、異常調的增殖性、復發性等，但本病在病理上屬于良性病變，而非惡性腫瘤[1]。這些特性能使其導致不同程度的骨質破壞，從而引起不同程度的聽力損失，甚至引發前庭功能障礙及面神經麻痹一系列病癥，使患者的生命安全受到嚴重威脅。基質金屬蛋白酶( Matrix metalloproteinases MMPs)它是一類能有效降解細胞外基質中鋅離子依賴型的一類蛋白酶，目前在骨質吸收與重建中的研究已取得進展，其家族中的 MMP-14是 MMPs家族中的一個Ⅰ型跨膜蛋白酶膜，活化的 MMP-14能夠直接和間接的降解基底膜( BM)和細胞外基質( ECM)成份，能夠降解細胞因子、生長因子受體或生長因子連接蛋白，在腫瘤細胞的浸潤、轉移中起重要的作用。MMP-14在MMPs中有不可代替的作用。本文中采用免疫組織化學方法來檢測 MMP-14在膽脂瘤型中耳炎上皮中的分布及表達水平，根據結果進一步探討在膽脂瘤上皮增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

31例膽脂瘤型中耳炎上皮組織標本均取自黑龍江省佳木斯大學附屬第一醫院耳鼻喉科2014-02～2014-11，經手術切除的后天繼發性膽脂瘤型中耳炎的膽脂瘤上皮組織，術后經蘇木精—伊紅染色( HE染色)確診是膽脂瘤上皮，其中，男性標本18例，女性標本13例，年齡16～61歲，平均42.6歲。另外選11例患者取外耳道正常皮膚組織作為對照。并將標本甲醛固定，再用酒精脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。

1.2 試劑

鼠抗人MMP-14多克隆抗體,SP試劑盒等均購自上海越研生物科技有限公司。

1.3 方法

所有標本都經過HE染色并明確病理診斷，切片厚度取4～5μm。MMP-14應用免疫組化SP法檢測。將石蠟切片、脫蠟、水化，后用3%H2O2室溫孵育10～20min，PBS 沖3min×3；經胰酶消化后37℃孵育箱25min，用PBS沖洗5min×3；再滴入血清室溫孵育5min，用PBS 沖洗；加1抗MMP-14，經4℃過夜，PBS沖洗5min×3;滴入生物素標記的2抗，再經室溫孵育、PBS沖洗；滴加過氧化物親和素酶溶液， 孵育、沖洗；滴加DAB顯色液，鏡下觀測并控制顯色時間；經自來水清洗后用蘇木復染、脫水、透明、封片。用已知陽性對照片作為陽性對照，用PBS 代替1抗作為陰性對照。

1.4 染色判定

本實驗以細胞內染色表現棕黃色顆粒視為陽性，并以任意五個400倍鏡下視野陽性細胞數比例分為：陰性(-)；弱陽性(+)；陽性()；強陽性()。陽性細胞數分別為：(15%；16%～30%；31%～50%)50%。

圖1 膽脂瘤上皮的HE染色SP×400

1.5 統計學方法

采用SPSS17.0統計軟件包處理。采用成組設計兩樣本均數比較的t檢驗來分析膽脂瘤上皮和正常外耳道上皮之間蛋白表達水平。

圖2 MMP-14在膽脂瘤上皮中陽性表達SP×400

圖3 正常外耳道皮膚的HE染色SP×400

圖4 MMP-14在外耳道皮膚中陰性表達SP×400

2 結果

在本實驗MMP-14膽脂瘤型中耳炎上皮組織和外耳道正常上皮組織的表達分布中，以細胞漿和細胞膜出現棕黃色顆粒為陽性結果，膽脂瘤型中耳炎上皮表現染色較強，多為陽性至強陽性表達。外耳道正常上皮組織細胞有表達，但染色較弱。MMP-14在膽脂瘤型中耳炎上皮和正常外耳道上皮中的陽性表達見表1。

表1 MMP-14在膽脂瘤及外耳道皮膚中的陽性表達

注:★P<0.05。

3 討論

膽脂瘤型中耳炎是耳鼻喉科中較常見的炎性疾病，是慢性化膿性中耳炎(單純型、骨瘍型與膽脂瘤型)中的一型，雖然他叫瘤但并非真正意義上的腫瘤，他是上皮組織不斷堆積而且破壞周圍組織，骨質而形成的，但他也具有許多類似惡性腫瘤的生物學特征，比如侵襲性、破壞性、非正常調控下的增殖性、復發性等，膽脂瘤上皮不斷堆積破壞正常中耳腔結

構和顳骨骨質。其破壞機理還未完全明了。有相關文獻顯示在無膽脂瘤的化膿性中耳炎(單純型、骨瘍型)中，骨吸收幾乎不明顯。因此推測膽脂瘤可能是顳骨骨吸收的重要因素[2]。近年來，MMPs家族在膽脂瘤型中耳炎中的作用明顯受到關注。MMPs家族可通過破壞細胞外基質、降解骨膠原等途徑，在病生過程中起到重要作用。在MMPs家族中目前已至少發現16種酶，其中MMP-14是MMPs家族中的特殊蛋白酶，除了具有原有的MMPs結構外，還有梭基端穿膜區(transmem-branedomainTM)，TM可使MMP-14表達為一種膜蛋白，主要分布在細胞膜表面，主要功能為降解細胞外的基質蛋白，并且是明膠酶-A酶原的表面受體激活物，目前研究表示，MMP-14可降解并破壞腫瘤患者的細胞外基質與基底膜，并且破壞阻止腫瘤細胞浸潤屏障。還使MMP-2酶原激活而進一步加強作用[3]。有實驗顯示膽脂瘤侵襲能力與MMP-2表達灰度有顯著相關性,表明MMPs在中耳膽脂瘤的骨質破壞中發揮重要作用[4]。研究證實MMPs直接參與生理及病理性溶骨機制, 其家族中的MMP-9是膽脂瘤骨質破壞中的很重要的一種酶,與膽脂瘤的破壞作用關系密切[5]。在炎癥癥狀較重的膽脂瘤中，基底膜不連續，缺少相對膠原的免疫反應物，所以膽脂瘤骨質破壞機制是一個復雜的、多因素共同作用過程，多種影響因素之間存在著相互關系。在本次實驗中顯示，MMP-14在膽脂瘤上皮組織中表達了很高的水平，在正常外耳道皮膚表達低水平，表明其在膽脂瘤型中耳炎的骨質破壞中發揮重要作用。骨質的降解和骨基質內膠原的水解過程都與活性的MMP-14有關，使膽脂瘤表現出類似惡性腫瘤的侵襲性和骨破壞性。由此可見，MMP-14在膽脂瘤的侵襲性及骨質破壞過程中起到重要作用。

[1]李冬,龔樹生,黃芳,等.中耳膽脂瘤研究進展及其與凋亡抑制蛋白survivin和Bcl-2的關系[J].臨床耳鼻咽喉頭頸外科雜志,2007,21(1):39-41Z

[2]BanerjeeAR,JamesR,NarulaAA,etal.Martixmetalloproteinase-1incholesteatoma,middleeargranulationsanddeepmeatalskin:acomparativeanalysis[J].ClinOtolaryngol, 1998,23:515-519

[3]SounniNE,BaramovaEN,MunautC,etal.ExPressionofmembranetyPe1matrixmetalloProteinase(MTI-MMP)inA2058melanomacells15AssociatedwithMMPactiveationandincreasedtumorgrowthandVasculariZation[J].IntJCaneer,2002，98(1):23-28

[4]周旭峰,姚雅芬.MMP-2和CD147在中耳膽脂瘤中的表達[J]. 黑龍江醫藥科學, 2008，31(3):27-28

[5]李江華,張愛華,周旭峰. 中耳膽脂瘤上皮組織中OPN和MMP9的表達及相關性研究[J]. 黑龍江醫藥科學,2013,36(2):78-79

2014年佳木斯大學研究生科技創新項目，編號：LM2014-032

張愛華(1962～)女，黑龍江佳木斯人，主任醫師，教授，研究生導師。研究方向：耳顯微外科研究。

周一莎(1984～)男，黑龍江佳木斯人，在讀研究生。E-mail:zhouyisha728@163.com。

R764.21

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1008-0104(2015)03-0035-02

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