腎綜合征出血熱患者血漿白細胞介素-18水平動態變化研究

王軍寧，郭維娟，杜 虹，于海濤，蔣 偉，白雪帆，王平忠

腎綜合征出血熱（hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS）是由漢坦病毒引起的以發熱、出血、PLT減少及不同程度腎損傷為臨床特征的急性傳染病[1]。典型病例有5期臨床經過，分別為發熱期、低血壓休克期、少尿期、多尿期和恢復期。根據疾病的嚴重程度，可分為輕型、中型、重型和危重型。本病的基本病理變化是全身廣泛性毛細血管損傷及通透性增加，但其具體致病機制至今尚未闡明。已有大量研究證實機體的固有免疫及適應性免疫在HFRS發病機制中發揮了重要作用，腫瘤壞死因子（tumour necrosis factor,TNF）-α、白細胞介素（interleukin,IL）-6、IL-4、IL-8和干擾素（interferon,IFN）γ等細胞因子在HFRS發病機制中發揮重要作用[2-3]。IL-18是一種促炎癥細胞因子，與機體多種炎癥反應密切相關[4-5]，但IL-18在HFRS患者不同病期和臨床型中的動態變化尚未見報道。為了探討IL-18在HFRS發病中的作用，我們檢測了不同病期及不同臨床型HFRS患者血漿IL－18水平變化，并進一步探討其與病程及病情的相關性，以期為HFRS發病機制研究提供依據。

1 對象與方法

1.1 對象 選取第四軍醫大學唐都醫院2011年10月—2014年1月收治的81例HFRS患者不同病期血樣145份。所有患者經血清學檢查HFRS特異性IgG和IgM陽性而確診，并排除合并其他病毒性感染、腎臟疾病、自身免疫相關性疾病及腫瘤性疾病，治療期間未用激素及其他免疫抑制劑。另選取15名來自本科室的志愿者為健康對照。共收集患者輕型12例，中型21例，重型25例，危重型23例。以及收集發熱/低血壓期血樣40份，少尿期血樣35份，多尿期血樣49份，恢復期血樣21份。根據疾病過程特點，把發熱/低血壓期和少尿期歸為急性期，把多尿期和恢復期歸為恢復期[6]。本項研究通過第四軍醫大學唐都醫院倫理委員會審批同意，所有患者都簽署知情同意書。

1.2 研究方法 無菌采集患者3ml靜脈血，1500 r/min離心10min，收集血漿并分裝，－80℃保存。采用購買于美國R&D公司的ELISA試劑盒測定血漿中的IL－18水平，實驗操作嚴格按照試劑盒說明書進行，每個樣本做2個復孔，取平均值。同時登記采血當天患者的 WBC、PLT、BUN、CRE（由本院檢驗科檢測）。

1.3 統計學處理 用SPSS 17.0軟件和GraphPad Prism 5軟件進行數據分析。計量資料呈非正態分布，用中位數表示，多組間比較用Kruskal－Wallis H檢驗比較總體差異，用Nemenyi秩和檢驗進行兩兩比較。急性期輕型/中型組與重型/危重型組IL－18水平呈正態分布且組間方差齊，2組比較用成組t檢驗。IL－18與其他檢測指標的相關性分析用Spearman相關分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 患者4個病期IL－18水平變化 患者IL－18水平的中位數在發熱/低血壓期、少尿期、多尿期、恢復期和正常對照值分別為 811、1008、581、485、167 pg/ml。其中發熱/低血壓期、少尿期、多尿期及恢復期IL－18水平均高于正常對照值（P均＜0.05）。發熱/低血壓期與少尿期IL－18水平差異無統計學意義，但此2期均高于多尿期和恢復期（P均＜0.05）；多尿期與恢復期IL－18水平差異無統計學意義。說明患者IL－18水平在發熱/低血壓期和少尿期上升到最高水平，到多尿期和恢復期明顯下降，但是仍然高于正常對照值。見圖1。

圖1 81例4個病期血漿IL-18水平變化發熱/低血壓期、少尿期、多尿期、恢復期及正常對照的樣本量分別為 40、35、49、21和 15；5組比較用 Kruskal－Wallis H 檢驗，H=70.990，P=0.000，組間多重比較用 Nemenyi秩和檢驗；*P＜0.05，**P＜0.001Figure 1 Changes of p lasma IL-18 level in 81 HFRS patients at 4 phases

2.2 急性期和恢復期IL－18水平變化 將4個病期合并為急性期和恢復期2個病期，發現血漿IL－18水平在急性期和恢復期均高于正常對照值（P均＜0.05），并且急性期高于恢復期（P＜0.05）。說明患者IL－18水平在急性期處于最高水平，到恢復期明顯下降，但是仍然未降到正常值范圍。見圖2。

圖2 患者急性期和恢復期IL-18水平變化3 組比較用 Kruskal－Wallis H檢驗，H=58.220，P=0.000，組間多重比較用Nemenyi秩和檢驗，***P＜0.001Figure 2 Changes of IL-18 level in patients at acute and convalescent phases

2.3 4種臨床型患者在急性期和恢復期IL－18水平變化 4種臨床型患者IL－18水平在急性期和恢復期均高于正常值（P均＜0.05），輕型患者急性期與恢復期比較差異無統計意義（P＞0.05），而中型、重型和危重型患者急性期均高于恢復期（P均＜0.05）。見圖3。

圖3 4種臨床型患者急性期和恢復期IL-18水平變化A.輕型；B.中型；C.重型；D.危重型。3 組比較用 Kruskal－Wallis H 檢驗，A，H=23.980，P=0.000；B，H=39.800，P=0.000；C，H=40.040，P=0.000；D，H=38.190，P=0.000。組間多重比較用 Nemenyi秩和檢驗，*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001Figure 3 Changes of IL-18 level in 4 clinical types of HFRS patients at acute and convalescent phases

2.4 患者急性期IL－18水平變化 將75例急性期4種臨床型合并為重型/危重型和輕型/中型，發現在急性期，重型/危重型IL－18水平較輕型/中型升高更為明顯（P＜0.05）。32例輕型/中型患者中僅有5例（15.6%）IL－18水平超過1000 pg/ml，然而43例重型/危重型患者中有22例（51.5%）超過1000 pg/ml，超過率是輕型/中型的3.3倍。見圖4。

圖4 急性期患者IL-18水平在輕型/中型組與重型/危重型組的比較2組之間比較用成組t檢驗，t=3.527，**P＜0.010Figure 4 Changes of IL-18 level in HFRS patients at acute phase between them ild/moderate group and the severe/critical group

2.5 IL－18與其他檢測指標相關性分析 患者IL－18水平與反映疾病進程和嚴重程度的指標WBC和BUN呈中等正相關（圖5A、5C），與CRE呈弱正相關（圖5D），與PLT呈中等負相關（圖5B）。見圖5。

圖5 患者血漿IL-18與WBC、PLT、BUN和CRE的相關性Figure 5 Correlations between plasma IL-18 level and WBC,PLT,BUN and CRE

3 討 論

HFRS是由漢坦病毒感染引起的一種人獸共患傳染病，主要臨床表現為發熱、低血壓休克、PLT減少、出血和腎損傷。血管內皮細胞是病毒感染的主要靶細胞[1]。可引起全身小血管和毛細血管的廣泛性損傷，其基本病理改變為血漿外滲。近年發現，漢坦病毒可通過β3－整合素受體破壞血管內皮細胞間緊密連接，使鈣黏蛋白內化分解，從而增強血管內皮細胞對內皮細胞生長因子的敏感性，使血管通透性增加[7－8]。但是單獨血管內皮緊密連接的損傷也難以解釋病毒感染后的血管通透性升高。目前普遍的觀點認為，HFRS的發病機制可能是多因素共同作用的結果。其中漢坦病毒感染后免疫介導的病理損傷是主要的誘導因素。體內外研究均表明漢坦病毒感染可誘導炎癥細胞因子/趨化因子的高水平表達[1－2]，它們在HFRS發病機制中可能發揮了重要作用。

IL－18 屬 IL－1 超家族成員[9]，是 Okamura等[10]于1995年從滅活的丙酸桿菌致敏后注射脂多糖的裸鼠肝細胞中分離并克隆出來的一種細胞因子，是主要由單核細胞/巨噬細胞產生的一種多生物活性的前炎性細胞因子，可誘導急性期炎性反應的產生，促進多種免疫細胞的分化及活化,同時可誘導T淋巴細胞和自然殺傷細胞產生IFNγ，對固有免疫及適應性免疫均有調節作用。其作用已在糖尿病、多發性硬化癥、神經性皮炎、類風濕性關節炎、銀屑病等自身免疫性疾病、敗血癥及AIDS等感染性疾病發病機制研究中有所報道[9，11-12]。

HFRS患者細胞因子/趨化因子的變化及與疾病嚴重程度的關系有諸多報道。Saksida等[13]研究發現血漿IL-10、IFNγ和TNF-α幾乎在所有HFRS早期都升高，重癥患者IL-10和TNF-α與正常對照值比較也明顯升高。這表明促炎癥因子和調節性細胞因子的失衡在HFRS發病中起著重要作用。

本研究檢測了 HFRS 患者 TNF-α、IL-6、IL-4、IL-8、IFN γ 和 IP-10 水平[2]，發現血漿 TNF-α、IL-6、IFNγ、IL-8和IP-10濃度與正常對照值相比明顯升高，最高濃度峰一般在發熱期、低血壓期及少尿期，并與疾病嚴重程度相一致。這表明漢坦病毒感染產生大量炎癥因子，導致超強免疫反應，在疾病早期可能引起“細胞因子風暴”，在調節免疫和清除病毒的同時，導致免疫損傷。

我們的研究表明，HFRS患者血漿IL-18水平在發熱期開始升高，在少尿期達峰值，同時腎損傷也是開始于發熱期，少尿期損傷最為嚴重。當進入多尿期，隨著尿量的增加，腎功能逐漸恢復正常，IL-18水平開始下降。恢復期IL-18水平與正常對照相比差異無統計學意義，此期患者的腎功能也恢復正常。相關分析還發現HFRS患者血漿IL-18水平與BUN、CRE呈中等程度正相關，BUN和CRE是腎損傷程度的主要標志，這些結果表明HFRS患者血漿IL-18在一定程度上反映了疾病的嚴重程度。已有研究表明血漿IL-18水平可預測肝移植后急性腎損傷，與糖尿病腎病密切相關，還可預測危重型患者急性腎損傷腎臟替代治療的短期預后[14-17]。

HFRS病毒血癥是短暫的，在發熱期末漢坦病毒基本被機體清除[18]。血漿IL-18在發熱期開始升高，少尿期達最高峰，并與疾病嚴重程度密切相關。這表明血漿IL-18在清除漢坦病毒方面的作用非常微弱，主要是通過炎癥介質介導的免疫反應參與HFRS的病理過程。IL-18可刺激T淋巴細胞的增殖，促進輔助性T細胞免疫應答，誘導IFNγ產生，增強FasL介導的細胞毒效應，另一方面IL-18直接作用于自然殺傷細胞，增強其自然殺傷活性[19]，從而在HFRS的發病過程中起了重要作用。

本研究發現IL-18水平不僅與疾病進程有關，而且重型/危重型患者在急性期明顯高于輕型/中型，同時血漿IL-18水平與WBC和PLT水平密切相關。WBC也是機體固有免疫充分活化的標志，PLT與疾病嚴重程度密切相關，并可預測急性腎損傷[20]。這表明IL-18血漿濃度與疾病嚴重程度密切相關。

綜上所述，IL-18在HFRS急性期明顯升高，在不同病期和臨床型之間有明顯變化，并且與反映疾病嚴重程度的臨床指標密切相關。因此，IL-18可用作臨床判斷病情變化的一個參考指標。此外，如果在HFRS早期阻斷IL-18的分泌，或者干預IL-18與其受體結合，可能會減輕疾病的嚴重程度、縮短病程，為HFRS的治療提供更多的措施。但是IL-18在HFRS中的致病機制尚不明確，還有待進一步研究。

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