漿細胞樣樹突狀細胞對頻繁復發的生殖器皰疹的免疫作用

楊閏平，李安信，李曉鵬，劉元林

生殖器皰疹一般由單純皰疹病毒（herpes simplex virus，HSV）－2（少數為 HSV－1）感染生殖器皮膚黏膜而導致簇集性水皰性的性傳播疾病，病情不活動時HSV可潛伏在局部神經節中。生殖器皰疹難以根治，容易復發。一般認為復發頻率與患者的免疫功能狀態有關，一年內復發超過6次為頻繁復發。

漿細胞樣樹突狀細胞（plasmacytoid dendritic cells,pDCs）主要功能和特征是在病毒或病毒來源的核酸刺激下分泌Ⅰ型干擾素（interferon,IFN）（IFNα/β），參與機體免疫反應以及橋接機體固有免疫和適應性免疫[1]。近年來發現pDCs在生殖器皰疹皮損中有浸潤，且HSV暴露后的pDCs在體外可促進T淋巴細胞的增殖，認為pDCs參與了生殖器皰疹的抗病毒免疫反應[2]。但有研究發現pDCs僅對系統感染的HSV有免疫反應，對局部感染的HSV無免疫反應，即pDCs對HSV的不同感染途徑有選擇性的免疫作用[3]。本文主要研究pDCs在復發性生殖器皰疹中的免疫作用，探索其在預防生殖器皰疹復發中的可能角色。

1 對象與方法

1.1 對象 選取我院門診確診的10例生殖器皰疹患者。入組標準：①年齡＞18歲男性；②病程1年以上；③復發頻率≥6次/年；④診斷標準符合《梅毒、淋病、生殖器皰疹、生殖道沙眼衣原體感染診療指南（2014）》[4]。剔除標準：①腫瘤患者、嚴重心腦血管病及結締組織病等系統疾病患者；②有酗酒習慣，抽煙＞20支/d。獲取知情同意后于靜息期（2次疾病發作間期）、發病早期（病程第1 d）和發病后期（病程第6 d）分別空腹抽取患者靜脈血6ml，3ml置于肝素抗凝管進行白細胞分離備用，3ml置于促凝管進行血清分離備用。選10名健康成年男性為對照組，其靜脈血處理同前。

1.2 外周血白細胞的分離 采用P8670人外周血白細胞分離液solarbio試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）分離白細胞，嚴格按試劑盒要求進行操作。方法如下：將1 ml新鮮抗凝血用組織稀釋液1∶1稀釋，加于1份分離液之液面上，1800 r/min離心25 min。棄去第1層血漿層，收集第2層細胞、第3層分離液層和第4層紅細胞層，置于含細胞洗滌液10ml的試管中，充分混勻后，1800 r/min離心30min。沉淀經1次洗滌后用紅細胞裂解液裂解紅細胞，再經3次洗滌去除紅細胞內溶物和碎片后取沉淀細胞。

1.3 流式細胞術檢測 PBS調整分離好的白細胞細胞密度至1×106個/ml，取1ml細胞懸液，依次加入CD123－FITC抗體（ab95782，艾博抗上海貿易有限公司）和BDCA－2－PE抗體（上海微蒙生物技術有限公司），4℃避光孵育30min，加PBS 1ml離心洗滌以洗去未標記抗體，加PBS調至200μl體積重懸細胞，上流式細胞儀檢測（BD FACSCalibur），以WinMD 12.9軟件記錄并分析結果。

1.4白細胞的培養上清液分離 分離白細胞以2×106個/ml的密度接種到25m l培養瓶中，用RPMI1640培養液（上海元龍生物技術有限公司）37℃培養24 h。分為培養液單純培養和加入1μg/ml的BDCA－2抗體（上海微蒙生物技術有限公司）預處理2組，分別加入PBS、IFNα1b（賽諾金，深圳科興生物工程有限公司，30 μg/ml）、HSV－2 333（南昌大學醫學院病毒所提供，100 TCID50/ml）和寡聚脫氧核苷酸（CpG－oligodeoxynueleotide,CpG ODN）（按參考文獻[5]進行，由上海生物工程公司合成，終濃度為6μg/ml）共培養24 h，24 h后以1000 r/m離心10min，取上清液于－20℃保存備用。

1.5 雙抗體夾心ELISA檢測血清及培養上清液IFNα/γ 具體實驗步驟嚴格按照IFNα/γ雙抗體夾心ELISA試劑盒（廈門慧嘉生物公司）說明書進行操作。標準品濃度按倍比稀釋。用酶標儀在450nm處檢測吸光度（OD值），根據標準曲線測出樣品濃度，結果以ng/L表示。

1.6 統計學處理 用SPSS 17.0軟件進行統計分析。計量資料呈正態分布，用x±s表示。患者指標在不同病期的變化比較用單因素重復測量設計的方差分析。外周血白細胞在IFNα等刺激下培養的上清液中IFNγ水平變化比較用自身配對t檢驗，差值比較用成組t檢驗。對照組外周血白細胞在BDCA－2抗體和IFNα等共刺激后培養上清液IFN γ水平的比較用單因素方差分析，多重比較用SNK法。相關數據均滿足正態分布，組間方差齊。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 不同病期外周血pDCs水平變化 以對照組pDCs水平（0.511±0.131）為正常參考值，患者疾病各期pDCs百分比均低于正常參考值，靜息期和發病早期差異無統計學意義，但發病后期明顯低于前2期，差異均有統計學意義（表1）。

表1 患者不同病期pDCs水平變化（n=10，x±s，%）Table 1 Changes of percentages of pDCs at different stages of genital herpes(n=10,x±s,%)

2.2 不同病期血清IFNα和IFNγ水平變化

以對照組IFNα和IFNγ水平為正常參考值，分別為（51.474±8.269）和（116.665±15.318）ng/L。患者IFNα水平在不同病期均高于正常參考值，發病早期高于靜息期，發病后期有所下降，但是仍高于靜息期，差異均有統計學意義。患者IFNγ水平在不同病期呈依次升高，差異均有統計學意義，靜息期略低于正常參考值，發病早期和后期均高于正常參考值（表2）。

表2 患者不同病期IFNα和IFNγ水平變化（n=10，x±s，ng/L）Table 2 Changes of serum IFNαand IFNγat different stages of genital herpes(n=10,x±s,ng/L)

2.3 IFNα、HSV－2和CpG ODN對外周血白細胞產IFNγ的影響 分離靜息期和對照組外周血白細胞體外培養24 h，ELISA分析培養上清液中IFNγ水平。結果顯示在加入IFNα、HSV－2和CpGODN后靜息期白細胞培養上清液中IFNγ水平顯著低于對照組，差異有統計學意義（表3）。

表3 外周血白細胞分別在IFNα、HSV-2和CpG ODN刺激下培養上清液中IFNγ水平比較（x±s,ng/L)Table 3 Comparison of IFNγin supernate of peripheral white blood cell culture stimulated by IFNα,HSV-2 and CpG-ODN(x±s,ng/L)

2.4 BDCA－2抗體對 IFN α、HSV－2和 CpG ODN刺激外周血白細胞產IFNγ的影響 BDCA－2抗體可顯著抑制HSV－2組和CpG ODN組培養上清液中IFNγ水平，與對照組差異無統計學意義；而BDCA－2抗體對IFNα組無影響，其上清液IFNγ水平顯著高于其余3組，差異有統計學意義（表4）。

3 討 論

pDCs來源于骨髓，存在于健康人血液及淋巴結組織中，皮膚組織中少見，占人外周血單核細胞的0.2%～0.8%，主要通過分泌大量IFNα參與機體的免疫調節，是其他白細胞分泌IFNα的100～1000倍[1]。pDCs內含有體內表達Toll樣受體7和9，結合自身核苷和病原體來源核苷，誘導pDCs分泌IFNα，從而發揮抗病毒作用[6]。既往研究發現生殖器皰疹皮損真皮有pDCs浸潤，參與抗病毒免疫[2]。但本研究發現在復發性生殖器皰疹靜息期和發病早期外周血pDCs百分比與對照組差異無統計學意義，發病后期pDCs數量顯著減少，說明靜息期和發病早期患者外周血pDCs儲備無明顯改變，而發病后期由于HSV激活復制，迅速動員pDCs分泌IFNα，可能存在耗竭性減少。

表4 對照組外周血白細胞在BDCA-2抗體與IFNα、HSV-2和CpG-ODN共刺激培養上清液中IFNγ水平比較（x±s,ng/L)Table 4 Com parison of IFNγin supernate of peripheral white blood cell culture stimulated by BDCA-2 and IFNα,HSV-2and CpG-ODN respectively in the controls(x±s,ng/L)

IFNα在人體抗病毒免疫中起重要作用，不僅直接抗病毒，也可以調節機體免疫，目前注射及外用IFN是各種病毒性疾病治療的常用方法[7－8]。研究發現復發性生殖器皰疹患者存在輔助性T細胞（T helper cells,Th）1和Th2細胞的失衡，表現為白細胞介素（interleukin,IL）－10產生過多，而 IFN γ及IL－2產生過少[9]。Mezentseva等[10]研究證明生殖器皰疹患者產生IFNα/γ能力明顯降低，因此復發性生殖器皰疹患者存在免疫失衡。本研究發現頻繁復發的生殖器皰疹患者靜息期外周血IFNα水平高于對照組，IFNγ水平低于對照組；IFNα水平在發病初期顯著升高，而發病后期迅速下降，IFNγ依然較對照組顯著升高。提示IFNα參與生殖器皰疹的早期免疫，而后期IFNγ進行持續抗病毒免疫。

既往研究表明復發性生殖器皰疹患者外周血CD4+/CD8+T淋巴細胞比值降低，直接影響患者免疫狀態，是導致生殖器皰疹復發的一個主要原因。在抗病毒免疫中Th1通過分泌IFNγ介導的細胞免疫起主要作用[11－12]。研究發現pDCs通過分泌IFN α作用于T細胞，使T細胞向Th1分化，分泌大量的IFNγ參與機體抗病毒免疫[2]。本研究發現IFN α、HSV－2和CpG ODN均可刺激外周血分離白細胞產生IFNγ。BDCA－2是pDCs細胞表面C型凝集素，是pDCs的一種特異性抗原，BDCA－2抗體可有效抑制pDCs產生IFNα/β[13]。本研究顯示BDCA－2抗體抑制HSV－2和CpGODN對外周血白細胞產生IFNγ，而對IFNα的誘導作用無效，說明pDCs參與了白細胞分泌IFNγ的免疫調節。復發性生殖器皰疹患者外周血白細胞培養上清液中IFNγ水平顯著低于對照組，提示其Th1細胞對pDCs反應性減低，或與患者外周血中Th1和Th2的失衡有關。

綜上所述，pDCs參與了復發性生殖器皰疹的免疫反應，其作用機制可能是通過分泌IFNα參與早期抗病毒免疫，以及誘導外周血Th1分泌IFNγ參與皰疹的免疫反應。頻繁復發的生殖器皰疹患者存在Th1淋巴細胞對pDCs介導的免疫反應減低。

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