1株快速增殖的HAV分離株基因型分析

白冰珂，胡 燕，鄔順全，姜棋予，楊瑞創，柴燕濤，李瑞生，侯 俊

HAV屬于小RNA病毒科嗜肝病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，全長約7500個核苷酸。HAV開放讀碼框架編碼一個大的前體蛋白，在病毒蛋白酶的作用下裂解產生11個不同大小的具有不同功能的蛋白，包括結構蛋白 VP1、VP2、VP3、VP4 以及非結構蛋白2A、2B、2C。一般HAV毒株在細胞培養中增殖緩慢，培養周期較長，為HAV滅活疫苗的生產帶來不便。我們從一例甲型肝炎患者糞便中分離到1株HAV毒株，該病毒具有在細胞培養中快速增長的特性：其培養周期為13 d，而一般HAV在細胞中的生長周期為1個月。為了解其基因特點，為HAV疫苗生產打基礎，本文參照文獻報道方法，對HAV302株進行了基因分型并對其編碼功能區序列進行分析[1-2]，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病毒和試劑 HAV302株病毒為本室分離鑒定，QIAamp?Viral RNA mini kit購自Qiagen公司（德國凱杰公司），反轉錄酶SuperscraptШ和Taq酶購自Invitrogen公司（美國英駿公司），T載體購自Promega公司（美國普洛麥格公司），其他試劑均為國產試劑。

1.2 病毒RNA的提取 用QIAamp?Viral RNA minikit提取病毒RNA，具體操作為：取140μl病毒培養液加入含carrierRNA的結合液AVL中，加入無水乙醇后過柱，用AW1、AW2溶液洗柱，14 000 r/m高速離心徹底去除乙醇，最后用洗脫液AVE洗脫病毒RNA。

1.3 反轉錄-聚合酶鏈反應（RT－PCR）

1.3.1 VP1/2A區段的 RT-PCR 取 2μl病毒RNA， 以 SuperscraptШ和 引 物 1 （序 列 ：5′-TTTTTTTTTTTTTGGTACCATTTACTGA）進行反轉錄擴增VP1/2A區段的168個核苷酸（上游引物：5′-GAATCAATGATGAGCAGA，下游引物：5′-AACCCCTTCATTTTCCTA），擴增條件為94℃，2min；94℃，30 s；47℃，30 s；72℃，30 s；擴增 40個循環。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小后進行序列測定。

1.3.2 2B/2C區段的RT-PCR 取2μl病毒RNA，以 SuperscraptШ和引物 1（序列：5′-TTTTTTTTTTTT TGGTACCATTTACTGA）進行反轉錄擴增2B/2C區段的1326個核苷酸（上游引物：5′-GGTGTTGGATTAATAGCAG，下游引物：5′-CTGAGACCACAACTCCATA），擴增條件為 94℃，2min；……