1株快速增殖的HAV分離株基因型分析

白冰珂，胡 燕，鄔順全，姜棋予，楊瑞創，柴燕濤，李瑞生，侯 俊

HAV屬于小RNA病毒科嗜肝病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，全長約7500個核苷酸。HAV開放讀碼框架編碼一個大的前體蛋白，在病毒蛋白酶的作用下裂解產生11個不同大小的具有不同功能的蛋白，包括結構蛋白 VP1、VP2、VP3、VP4 以及非結構蛋白2A、2B、2C。一般HAV毒株在細胞培養中增殖緩慢，培養周期較長，為HAV滅活疫苗的生產帶來不便。我們從一例甲型肝炎患者糞便中分離到1株HAV毒株，該病毒具有在細胞培養中快速增長的特性：其培養周期為13 d，而一般HAV在細胞中的生長周期為1個月。為了解其基因特點，為HAV疫苗生產打基礎，本文參照文獻報道方法，對HAV302株進行了基因分型并對其編碼功能區序列進行分析[1-2]，現將結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 病毒和試劑 HAV302株病毒為本室分離鑒定，QIAamp?Viral RNA mini kit購自Qiagen公司（德國凱杰公司），反轉錄酶SuperscraptШ和Taq酶購自Invitrogen公司（美國英駿公司），T載體購自Promega公司（美國普洛麥格公司），其他試劑均為國產試劑。

1.2 病毒RNA的提取 用QIAamp?Viral RNA minikit提取病毒RNA，具體操作為：取140μl病毒培養液加入含carrierRNA的結合液AVL中，加入無水乙醇后過柱，用AW1、AW2溶液洗柱，14 000 r/m高速離心徹底去除乙醇，最后用洗脫液AVE洗脫病毒RNA。

1.3 反轉錄-聚合酶鏈反應（RT－PCR）

1.3.1 VP1/2A區段的 RT-PCR 取 2μl病毒RNA， 以 SuperscraptШ和 引 物 1 （序 列 ：5′-TTTTTTTTTTTTTGGTACCATTTACTGA）進行反轉錄擴增VP1/2A區段的168個核苷酸（上游引物：5′-GAATCAATGATGAGCAGA，下游引物：5′-AACCCCTTCATTTTCCTA），擴增條件為94℃，2min；94℃，30 s；47℃，30 s；72℃，30 s；擴增 40個循環。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小后進行序列測定。

1.3.2 2B/2C區段的RT-PCR 取2μl病毒RNA，以 SuperscraptШ和引物 1（序列：5′-TTTTTTTTTTTT TGGTACCATTTACTGA）進行反轉錄擴增2B/2C區段的1326個核苷酸（上游引物：5′-GGTGTTGGATTAATAGCAG，下游引物：5′-CTGAGACCACAACTCCATA），擴增條件為 94℃，2min；94 ℃，30 s；50℃，30 s；72℃，2min；擴增40個循環。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小后進行序列測定。

1.4 引物合成及序列分析 引物合成和核酸序列測定均由Invitrogen公司進行，測序結果用DNA STAR和CLUSTAL序列分析軟件進行處理。

1.5 用于序列比較的HAV病毒株的選擇 根據Robertson等[1]對世界各地HAV株進行基因分型的結果，結合我國已分離的HAV病毒株基因型，我們從GenBank中選取了7種（Ⅰ～Ⅶ是HAV的7種基因型；ⅠA型和ⅠB型、ⅢA型和ⅢB型為同一基因型Ⅰ型和Ⅲ型的不同亞型）HAV基因型的14個代表毒株，包括PRC16（ⅠA型，GenBank序列號：L07716.1）、PRC37（Ⅰ A 型，GenBank 序 列號：L07717.1）、S85-1（ⅠA 型，GenBank 序 列號：L07715.1）、CHINA81（ⅠA 型，GenBank 序列號：L07712.1）、LCDC-1（ⅠA 型，GenBank 序列號：L07714.1）、MBB（ⅠB 型，GenBank 序列號：M20273.1）、HM175（ⅠB 型，GenBank序列號：U68700.1）、CF-53（Ⅱ型，GenBank序列號：L07693.1）、PA21（ⅢA型，GenBank序列號：L07730.1）、M-25（ⅢB 型，GenBank 序列號：L20544.1）、CY145（Ⅳ型，GenBank序列號：L07732.1）、AGM-27（Ⅴ型，GenBank 序列號 ：D00924.1）、JM55 （Ⅵ 型 ，GenBank 序 列 號 ：L07731.1） 和 SLF88（Ⅶ型，GenBank序列號：L07729.1）。

2 結 果

2.1 VP1/2A區序列的擴增與鑒定 通過RT-PCR成功擴增出目的片段，電泳顯示約170 bp，與預計大小相符。

2.2 HAV302株的基因型分析 根據文獻報道，以VP1/2A區168個核苷酸序列為HAV基因分型標準[1]，運用DNA STAR軟件將 HAV302與 GenBank中收錄的其他14株HAV VP1/2A區基因型序列進行比較。結果顯示HAV302株與MBB株VP1/2A區序列有1個堿基不同（99C→T），與HM175株有8個堿基不同，而與其他9個病毒株則至少有10個堿基不同（圖1）。其相應的氨基酸序列比較顯示與MBB株完全一致，而與其他10個病毒株則至少有1個氨基酸不同（圖2）。通過分析發現HAV302株與MBB株親緣性最高，初步推斷HAV302株與MBB株屬同一亞型，為基因Ⅰ型中的ⅠB亞型[3]。

將除HAV302株的14個病毒株VP1/2A區核苷酸和氨基酸序列用CLUSTAL軟件兩兩進行同源性比較，結果顯示不同基因型間的核苷酸同源性為69.6%（117/168）～91.1%（153/168），同一基因型內不同亞型間核苷酸的同源性為 86.9%（146/168）～100%（168/168），同一亞型不同分離株間核苷酸同源性為 94.6%（159/168）～100%（168/168）；而同一基因型內氨基酸序列的同源性為 96.4%（54/56）～100%（56/56），不同基因型之間氨基酸序列的同源性為 83.9%（47/56）～100%（56/56）（表 1）。HAV302株核苷酸序列與MBB株同源性為99.4%，與HM175株同源性為95.2%，與其他病毒株同源性為70.2%～93.5%；其氨基酸序列與MBB株同源性為100%，與其他病毒株同源性為85.7%～98.2%，進一步證實HAV302株與MBB株同屬ⅠB亞型。

2.3 不同基因型HAV VP1/2A區序列的進化樹分析 在初步判斷HAV302株基因型的基礎上，將其與從GenBank中選取的7種HAV基因型的14個代表毒株的VP1/2A區核苷酸序列進一步用DNA STAR軟件進行進化分析，得到種系發生樹（phylogenetic tree）。進化結果分析顯示，HAV302株與MBB和HM175株處于進化樹的同一進化枝上，同屬IB亞型，且與MBB株親緣關系最近；該病毒株與HAV其他基因型的病毒株進化關系較遠（圖3）。

2.4 HAV302株編碼基因序列的分析 將HAV302株的編碼區各基因序列與MBB株相應序列比較，發現2B和2C區核苷酸序列差異最大：其中2B區有4個核苷酸不同，同源性為98.96%（380/384）；2C區有17個核苷酸不同，同源性為98.28%（973/990）。推導的氨基酸序列比較，2B區有2個氨基酸變異，同源性為98.43%（126/128）；2C區有9個氨基酸變異，同源性為97.27%（321/330）。見表2。

3 討 論

HAV的基因組結構和體外細胞培養特性不同于其他小RNA病毒，其VP1/2A連接物不被病毒蛋白酶裂解，而由細胞內的蛋白酶將2A蛋白降解，從而使VP1蛋白釋放出來，參與病毒的組裝和成熟[4]。VP1/2A連接區VP1的突變可能因影響病毒蛋白加工從而影響病毒的成熟，而2A蛋白則可能和病毒顆粒的組裝有關[5]。HAV抗原生產制備采用常規培養法，一般在1個月左右收獲病毒，黃麗娟等[6]采用轉鼓培養技術將HAV的培養時間縮短到18 d即可收獲病毒，其HAV抗原滴度為1∶8。我們分離的HAV302株雖然有快速繁殖能力（培養13 d即可收獲病毒，抗原滴度達1∶50），但是其VP1/2A區序列和MBB株同源性高達99.4%，而且相應氨基酸序列同源性為100%，表明病毒的快速繁殖與VP1/2A區不相關。而文獻報道2B和2C蛋白在整個基因和RNA復制過程中發揮重要作用，即和體外適應細胞培養及有效增殖相關，尤其是2B區的變異可能加快病毒在細胞培養中的生長速度[7]。另據研究報道2B/2C區基因的突變是細胞適應所必需的，2B/2C的協同突變可使HAV適應組織培養，促進病毒繁殖，這可能與2B和2C在細胞中的獨特作用有關：2B及其前體2BC蛋白影響著細胞膜的改變，2B蛋白還可以通過阻斷干擾素調節因子-3的活化來抑制細胞內干擾素β基因的轉錄，該機制被認為對病毒的生存至關重要[8-11]。我們在研究過程中也發現HAV302株的2B和2C區變異高于其他蛋白編碼區，提示其快速繁殖能力的獲得可能在于2B和2C蛋白的變異，尤其是其優勢蛋白2B蛋白的變異。但目前該結論僅限于推測階段，其具體基因功能須在后續的研究中加以證實。

圖1 不同HAV病毒株VP1/2A區核苷酸序列比較Figure 1 Comparison of nucleotide sequences covering the adjacent region of VP1/2A fragments among different HAV strains

圖2 不同HAV病毒株VP1/2A區氨基酸序列比較Figure 2 Com parison of am ino acid sequences covering the adjacent region of VP1/2A fragments among different HAV strains

HAV基因分型方法及型別的建立，使HAV的流行病學研究從宏觀進入到微觀分子水平。用HAV基因分型理論分析HAV的流行特征及其流行因素，確定暴發或流行與傳染源之間的內在聯系，對甲型肝炎的預防和控制具有重要意義。Robertson等[12]以HAV VP1/2A連接區168個核苷酸的不同序列作為分型標準對全球29個國家的152株HAV進行分型比較，發現HAV各型間該區的核苷酸序列同源性為75%～85%，相應的氨基酸序列同源性為82%～97%。我們將HAV302株和其他HAV毒株VP1/2A區的核苷酸和氨基酸序列進行比較，發現該分離株核苷酸序列與MBB株的同源性最高為99.4%，與CY145株的同源性最低為70.2%；相應的氨基酸序列同源性與MBB株最高為100%，同CY145株的同源性最低為85.7%。

表1 HAV302核苷酸序列(VP1/2A，168nt)及相應氨基酸序列(VP1/2A，56aa)同源性比較(%)Table 1 Homology com parison of nucleotide sequences(HAV302 VP1/2A,168nt)and am ino acid sequences(HAV302 VP1/2A,56aa)(%)

圖3 HAV302株VP1/2A區遺傳進化分析Figure 3 Phylogenetic tree for HAV302 based on the partial sequences of the VP1/2A fragments

表2 HAV302株與MBB株2B、2C區核苷酸及氨基酸序列比較Table 2 Comparison of the homology of nucleotide sequences and am ino acid sequences between HAV302 and MBB 2B and 2C fragments

我國屬于HAV高流行區，1992年Roberston等[12]對世界各地HAV株進行基因分型，來自我國的5株病毒均為ⅠA 亞型（PRC16、CHINA81、S85-1、LCDC-1和CHINA83）。但是隨著經濟的發展和人員交流增多，我國HAV基因型分布也日益多元化，逐漸發展為以ⅠB亞型為主。以往報道的H2株HAV均屬于ⅠB亞型[6,13]，而我們分離的這株HAV也屬ⅠB亞型。當前預防甲型肝炎發生和流行惟一有效的手段仍是接種疫苗，而目前常用的HAVH2株減毒活疫苗和HM175株滅活疫苗的基因型均為ⅠB亞型，與我們分離的HAV302株相同，而HAV302株擁有的快速繁殖能力則為其改造成高產HAV疫苗及HAV基因功能的進一步研究奠定了基礎。

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