烏司他丁對腸缺血再灌注損傷大鼠小腸細胞凋亡的影響

范玲玲，侯明星，陳冬梅,丁翠霞，鐘海燕(內蒙古醫科大學第一附屬醫院，呼和浩特 010050)

烏司他丁對腸缺血再灌注損傷大鼠小腸細胞凋亡的影響

范玲玲，侯明星，陳冬梅,丁翠霞，鐘海燕(內蒙古醫科大學第一附屬醫院，呼和浩特 010050)

摘要：目的探討烏司他丁對腸缺血再灌注損傷大鼠的保護作用及其機制。方法 將60只健康Wistar大鼠隨機分為對照組(A組)、腸缺血再灌注后0 h組(B1組)、腸缺血再灌注后2 h組(B2組)、烏司他丁治療腸缺血再灌注后0 h組(C1)、烏司他丁治療腸缺血再灌注后2 h組(C2組)各12只。B1、B2、C1、C2組夾閉腸系膜上動脈(SMA)60 min制作腸缺血再灌注損傷模型，并于手術前經尾靜脈B1、B2組各注入生理鹽水2 mL,C1、C2組各注入烏司他丁5×104U/kg；A組僅分離SMA，不夾閉血管。取A、B1、B2、C1、C2各組大鼠的小腸組織，光鏡下觀察組織學改變，TUNEL法檢測小腸細胞凋亡率。結果 光鏡觀察發現，A組小腸黏膜基本正常；B1組小腸黏膜及絨毛排列輕度紊亂，無黏膜變性、壞死，出現上皮下間隙擴大，腺體輕度受損及毛細血管充血；B2組小腸絨毛水腫明顯，黏膜及絨毛排列明顯紊亂，黏膜上皮脫落呈現糜爛，腺體嚴重受損；以上變化在絨毛頂端尤為顯著。C1、C2組小腸黏膜充血、水腫及上皮糜爛壞死的程度均較B1、B2組減輕。B1、B2組大鼠細胞凋亡率較A組升高(P均<0.01)。C1組與B1組、C2組與B2組比較細胞凋亡率均降低(P均<0.05)。結論 烏司他丁可抑制小腸細胞凋亡，有助于減輕由于缺血再灌注引起的腸道損傷。

關鍵詞：缺血再灌注；細胞凋亡；小腸細胞；烏司他丁；大鼠

小腸對缺血再灌注高度敏感，長時間缺血或缺血再灌注可以使細胞線粒體發生不可逆損傷。Ikeda等[1]證實，細胞凋亡是小腸缺血再灌注損傷時黏膜細胞死亡的主要機制。2014年2～6月，我們通過觀察烏司他丁對腸缺血再灌注大鼠小腸組織損傷程度及小腸細胞凋亡的影響，以探索烏司他丁對小腸缺血再灌注的保護作用及其機制。

1材料與方法

1.1腸缺血再灌注模型制作將60只健康雄性Wistar大鼠 (內蒙古大學動物實驗中心提供，體質量200～250 g，于溫度21～27 ℃、濕度45%～55%喂養)隨機分為對照組(A組)、腸缺血再灌注后0 h組(B1組)、腸缺血再灌注后2 h組(B2組)、烏司他丁治療腸缺血再灌注后0 h組(C1)、烏司他丁治療腸缺血再灌注后2 h組(C2組)各12只。B1、B2、C1、C2組大鼠通過夾閉腸系膜上動脈(SMA)制作腸缺血模型。大鼠腹腔注射氯胺酮(100 mg/kg)麻醉，常規碘伏消毒后取腹正中切口3～4 cm，鈍性分離SMA根部；以血管夾夾閉SMA根部，完全阻斷血流60 min，之后放松血管夾，使腸道血流恢復形成缺血再灌注。A組僅暴露SMA根部，但不夾閉。缺血再灌注、烏司他丁治療大鼠分別于夾閉SMA前30 min尾靜脈注射生理鹽水2 mL、烏司他丁5×104U/kg(廣東天普生化醫藥股份有限公司)，A組不干預。

1.2組織形態學觀察取A、B1、B2、C1、C2組大鼠距回盲部10 cm以上的小腸組織5 cm，立即投入生理鹽水中沖洗，置于10%甲醛溶液中固定。然后將小腸從固定液中取出，取完整一圈放入包埋盒，流水沖洗24 h。梯度乙醇脫水、透明、石蠟包埋、切片、HE染色，光鏡下觀察組織學改變。

1.3細胞凋亡檢測石蠟包埋切片常規脫蠟至水，檸檬酸緩沖液中微波修復4 min，迅速加入雙蒸水(25 ℃)冷卻至室溫；PBS液沖洗5 min，加封閉液(含3%BSA和20%小牛血清的Tris-Hcl液)，置室溫30 min；PBS液沖洗2次，每次5 min，加50 μL TdT酶反應液37 ℃溫盒孵育60 min；PBS液沖洗3次，每次5 min，滴加50 μL Streptaridin-HRP工作液37 ℃溫盒孵育30 min；PBS液沖洗3次，每次5 min，滴加50～100 μL顯色底物二氨基聯苯胺工作液，室溫顯色反應10 min，自來水洗3次，蘇木精復染、脫水封片。以胞核呈棕色者為陽性染色，鏡下觀察細胞凋亡在組織中的定位，每張切片選擇有代表性的視野，計算細胞凋亡率。

2結果

2.1各組小腸組織學改變光鏡觀察發現，A組小腸黏膜基本正常；B1組小腸黏膜及絨毛排列輕度紊亂，無黏膜變性、壞死，出現上皮下間隙擴大，腺體輕度受損及毛細血管充血；B2組小腸絨毛水腫明顯，黏膜及絨毛排列明顯紊亂，黏膜上皮脫落呈現糜爛，腺體嚴重受損；以上變化在絨毛頂端尤為顯著。C1、C2組小腸黏膜充血、水腫及上皮糜爛壞死的程度均較B1、B2組減輕。

2.2各組細胞凋亡率比較B1、B2組大鼠細胞凋亡率較A組升高(P均<0.01)。C1組與B1組、C2組與B2組比較細胞凋亡率均降低(P均<0.05)。見表1。

表1　各組細胞凋亡率比較(%，

注:與A組比較，*P<0.01；與B1組比較，△P<0.05；與B2組比較，△△P<0.05。

3 討論

以往人們對各實質臟器缺血再灌注進行大量研究發現，由于小腸組織結構的特殊性，使得小腸成為目前已知的對缺血再灌注最敏感的組織之一[2～5]。臨床上小腸的缺血再灌注常發生于腹部外傷、腸系膜血管缺血性疾病、感染和小腸移植過程中。

細胞凋亡是缺血再灌注損傷的表現途徑之一，多種臟器、組織歷經缺血再灌注后均發現有細胞凋亡現象[6～8]。適度的細胞凋亡是機體維持細胞數量穩態的重要手段，而凋亡過度則會造成機體損傷。Ikeda等[1]證實，小腸缺血再灌注損傷細胞凋亡的誘導機制包括：①氧自由基直接造成細胞損傷；②受損的小腸上皮及內皮細胞釋放炎癥遞質，加重全身炎性反應和細胞凋亡；③腸黏膜屏障功能不全，菌群移位促進黏膜細胞凋亡。

研究顯示，烏司他丁對小腸缺血再灌注損傷的保護機制可能通過多途徑實現：①通過其蛋白酶的活性，穩定溶酶體膜和細胞膜，抑制中性粒細胞活性及其與血管內皮細胞間的黏附和向血管外游走，減少了組織細胞破壞產生的炎性刺激物對巨噬細胞的進一步激活，打斷了炎性激活的惡性循環，減少了TNF-ɑ及IL-1的產生[9]；②烏司他丁抑制細胞凋亡可能是通過抑制PMN的激活，減少炎性因子的釋放，抑制氧自由基的產生而發揮作用的[10]；③ 烏司他丁抑制脂多糖刺激單核細胞產生血栓烷A2 (TXA2) 和其代謝產物TXB2的合成；抑制TNF-α刺激血管內皮細胞間黏附分子-1(ICAM-1)的表達, 而后者可介導白細胞與血管內皮細胞間的黏附及白細胞向血管外游走, 導致微循環栓塞和加重組織缺血、缺氧損傷。由于TXA2和ICAM-1生成減少, 從而有益于微循環狀況的改善。

本研究顯示，大鼠缺血再灌注后，小腸絨毛細胞凋亡增加，缺血再灌注后即刻細胞凋亡率明顯高于對照組；缺血再灌注2 h后，細胞凋亡率最高，說明缺血再灌注損傷可引起小腸細胞凋亡率增加。烏司他丁治療大鼠缺血再灌注各時點小腸細胞凋亡率均降低，與缺血再灌注未治療大鼠比較有統計學差異。證實烏司他丁可以降低缺血再灌注損傷時細胞凋亡率，抑制細胞凋亡，減輕由于缺血再灌注引起的腸道損傷。

參考文獻：

[1] Ikeda H, Suzuki Y, Koike M, et al. Apoptosis is a major mode of cell death caused by ischemia and ischemia/reperfusion injury to the rat intestinal epithelium[J]. Gut, 1998,42(6):530-537。

[2] Polunovsky VA， Wendt CH， Ingbar DH, et al. Induction of endothelial cell apoptosis by TNF-α: modulation by inhibitors of protein synthesis[J]. Exp Cell Res, 1994,214(2):584-594。

[3] Rossig L, Haendeler J, Mallat Z, et al. Congestive heart failure induces endothelial cell apoptosis: protective role of carvedilol[J]. J Am Coll Cardiol, 2000,36(7):2081-2089。

[4] Messmer UK, Briner VA, Pfeilschifter J. Basic fibroblast growth factor selectively enhances TNF-alpha induced apoptotic cell death in glomerular endothelial cells: effects on apoptotic signaling pathways[J]. J Am Soc Nephro1, 2000,11(12):2199-2211。

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[6] Majno G, Jotis I. Apoptosis, oncosis and necrosis: An overview of cell death [J]. Am J Pathol, 1995,146(2):3-15。

[7] 李琳，張楠，解基良，等.腸缺血再灌注大鼠模型腸黏膜上皮細胞凋亡的觀察[J].山東醫藥，2007，47(33):37-38。

[8] Varga J, Toth S, Stasko P, et al.Athological status of remote vital organs in acute and subacute phases[J]. Ann Transplant, 2012,17(1):11-20。

[9] Nakatani K, Takeshita S, Tsujimoto H, et al. Inhibitory effect of serine protease inhibitors on neutrophil-mediate endothelial cell injury[J]. Leukic Biol, 2001，69(2):241-247。

[10] Antal-Szalmas P, Poppelier MJ, Sumegi A, et al. Spare CD14 molecules on human monocytes enhance the sensitivity for low LPS concentrations[ J ]. Imunol Lett, 2004,93(1):11-15。

(收稿日期：2014-09-12)

通信作者：侯明星

中圖分類號：R965

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2015)05-0028-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2015.05.010