清熱類藥物高效液相色譜分析有效成分含量的方法研究

季曉紅

(江蘇省張家港市第三人民醫院，江蘇 張家港 215611)

中藥作為中華民族的瑰寶一直沿用了幾千年，在疾病的防治上發揮著重要的作用，中藥藥劑一直是中藥中最具價值的部分，具有其獨特的治療優勢［1］。首先中藥制劑通過各種藥味的協同配合，形成具有獨特療效和低毒副作用的優勢，其次中藥制劑具有持久性、穩定性和高效性，其藥效使用率高，另外中藥制劑的儲存相對較為方便，給藥方式簡單［2］。近年來我國的中藥制劑的研制取得了很大的進展，特別是中藥復方的水平較之前有了很大的提高。事實上中藥制劑的制備是一個較為復雜的過程，成分的提取需要用到不同的工藝，這種技術上的限制也造成了中藥制劑的藥物控制上不能做到面面俱到，質量出現良莠不齊的表現［3］。為了讓中藥制劑的質量得到保證，對其含量和有效成分進行分析和把握，才能夠讓中藥制劑的制備更為的可控和精確，本文通過高效液相色譜法對清熱類藥物的有效成分進行研究，總結提取的相關方法，供今后的中藥提取參考。

1 材料和方法

1.1 主要試劑、細胞與儀器

試劑:大黃素(中國藥品生物制品檢定所，批號115239-202100);黃芩苷(中國藥品生物制品檢定所，批號0754-9872);鹽酸小檗堿(中國藥品生物制品檢定所，批號54633-30984)。清肺抑火片分別由三家公司提供:云南白藥集團大理藥業有限公司，批號110419;云南省曲靖藥業有限公司，批號110423;修正藥業集團股份有限公司，批號110644。磷酸二氫鉀(分析純，上海碩盟生物);乙腈、甲醇(色譜純，美國DIKMA公司);水為雙蒸水。

儀器:高效液相色譜儀(美國Queue systems);電子分析天平(日本奧林巴斯);超聲波清洗機(美國BD公司);高轉速冷凍離心機(德國BiofugeStratos)。

1.2 方法

色譜柱:Waters Atlantis dC18(250mm×4.5mm，5μm);流動相:0.01mol/L的KH2PO4溶液(H3PO4調pH值為2.8)，乙腈(95∶5，V/V);洗脫程序采用梯度洗脫法:0～5min，26%A→26%A;5～10min，26%A→48%A;10～19min，48%A→60%A;流速1.0ml/min;波長根據流動相切換0～5min，316nm;6～10min，347nm;10～19min，254nm，溫度控制在28℃，進樣量每次20μl。

1.3 對照品溶液的制備

鹽酸小檗堿、大黃素、黃芩苷取適量，通過甲醇稀釋制備到濃度為340、448、424μg/ml的單一對照品，分別取鹽酸小檗堿5.0ml、大黃素4.0ml、黃芩苷13.0ml，再加入色譜級的甲醇稀釋得到混合對照品進行儲存。

1.4 供試品溶液的制備

對樣品進行研磨，取0.3g至100ml的量瓶中，加入70%甲醇15ml，進行超聲，約1h后靜置，離心過濾，取濾液轉移至容量瓶當中，稀釋后搖勻，得到供試品。

1.5 提取方法的選擇

樣品的提取率根據公式計算:Y=(C×V)×10-3/W，其中C為標準曲線求出來的樣品濃度，V為溶液的體積，W為樣品的重量。為了使被測的清熱藥物全部提取完整，本研究采用不同提取時間、溶液比列等方法進行提取，摸索出最佳的甲醇濃度和超聲時間。

1.6 流動相的選擇

主要考察了甲醇-磷酸二氫鉀溶液、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸二氫鉀溶液、乙腈-三乙胺溶液、甲醇-三乙胺溶液的流動相選擇，通過分離的效果選擇柱壓的大小，是否有拖尾的情況選擇合適的流動相。

2 結果

2.1 線性關系的考察

取出對照品的混合儲存液，對三種對照品分別制備一系列濃度的溶液，其中鹽酸小檗堿分別為2.24、4.48、8.96、17.92、44.8、89.5μg/m l，大黃素分別為1.36、2.72、5.44、10.88、27.2、54.5μg/ml，黃芩苷分別為5.512、11.02、22.06、44.10、110.2、220.5μg/ml。吸取20μl注入色譜儀中，以峰面積Y對濃度X進行線性觀察，回歸方程分別為鹽酸小檗堿:Y=41.93X-0.0392;大黃素:Y=19.96X-45.52;黃芩苷:Y=31.34X-46.98。結果，鹽酸小檗堿2.24～89.60μg/ml;大黃素:1.36～54.40μg/ml;黃芩苷5.51～220.50μg/ml范圍內三者均與峰面積呈良好的線性關系。

2.2 精密度實驗

吸取混合儲存液20μl，進行6次重復，對峰面積進行測定。結果顯示，三者的峰面積RSD分別為小檗堿1.4，大黃素1.7，黃芩苷0.87，結果見表1。

表1 精密度實驗結果

2.3 穩定性實驗

取儲存液20μl，分別在0、2、4、6、8、12h六個時間點進行檢測，對峰面積進行計算。結果顯示，三者的峰面積RSD分別為小檗堿0.74，大黃素1.8，黃芩苷2.1，溶液在12h之內都處于穩定狀態，見表2。

表2 穩定性實驗結果

2.4 重復性實驗

同一樣品，測定供試品，對其峰面積進行檢測。三者的峰面積RSD分別為小檗堿0.69，大黃素1.8，黃芩苷1.2，說明本方法檢測重復性好，見表3。

表3 重復性實驗結果

2.5 樣品含量測定

樣品分別為三個廠家的樣品，分別取3份按上述的方法制備成供試品，然后根據上述的對照品測試的色譜條件進行進樣檢測，對峰面積測定，計算出含量，結果見表4。

表4 樣品含量測定結果

2.6對照品混合溶液(A)和供試品溶液(B)色譜圖見圖1。

3 討論

中藥制劑的質量監控早在《太平惠民和劑局方》中就有相關的記載。隨著近年來我國中藥制劑的發展和國際化要求，中藥復方制劑的藥物控制也應該得到更為深入的研究，質量的控制顯得尤為關鍵，由于中藥制劑是一個相當復雜的提取過程，其質量監控難以全面化，因此質量控制問題一直是阻礙中藥制劑發展并影響其國際化、產業化進程的重要原因。有效成分的控制成為中藥現代化的重要問題，鑒于中藥分析技術的不斷發展，新的控制模式和檢測技術的推出，給中藥的質量標準提供了重要的思路。

現階段中藥制劑研究領域的質量控制應該遵循藥物質量準則，主要方法就是藥效的物質基礎研究，利用現代的分離技術如超濾技術、超聲技術、膜分離技術等對藥物進行提取分離，在藥效的基礎上對有效成分進行藥理的分析，尋找出復方治療中有效成分，從而作為藥物含量測定的標準。

圖1 對照品混合溶液(A)和供試品溶液(B)色譜圖

清熱類藥物作為廣泛應用于臨床的常用藥物，該類藥物不僅僅能夠抗病源微生物，還可以調節人體的免疫功能，具有廣泛的抗炎解熱的藥理活性，通過調節自身的免疫力提高人體的抗病能力。本文通過摸索實驗條件，以清肺抑火片為例，探討清熱類藥物高效液相色譜分析有效成分的含量的方法學，選取了不同產家的清熱類藥物中清肺抑火片中黃芩、黃柏、大黃的活性成分黃芩苷、鹽酸小檗堿、大黃素，通過高效液相色譜分析建立三種指標成分含量的同步測定分析方法。結果顯示，高效液相色譜分析可以取得良好的分離效果，獲得較高的產品質量，雖然不同廠家的藥物均達到合格藥品的標準，但是藥物之間還是存在一定的差異。

綜上所述，本研究拓展了高效液相色譜在藥物質量的控制和監督方面的實際應用，證實了高效液相色譜分析對于清熱類藥物具有準確性高、方法精密度好的特點，符合中藥藥物的檢測要求，通過不同廠家的藥物的對比分析，均為合格藥品，但是藥物存在一定的差異性，這可能與原材料的產地以及廠家的制備工藝有關，在差異在可控范圍之內都將發揮一定的臨床療效，這也提示了仍有許多中藥的可控性問題需要我們進一步深入研究，從全方位多角度評價中藥制劑的優劣。

［1］李文烈，曹海芳，魏剛，等.中藥制劑質量控制的研究進展［J］.中國執業藥師，2012，9(7):32-35.

［2］楊勝，張定堃，蘇柘僮，等.中藥復方制劑質量控制的研究［J］.中國醫藥生物技術，2010，5(5):387-391.

［3］伍振峰，鄭琴，楊明，等.中藥制劑質量控制的方法模式分析與研究［J］.中國中藥雜志，2012，37(9):1332-1336.