miR-20b對大腸癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制的研究

吳巍蕓　周　宇

作者單位：524001 廣東醫學院附屬醫院消化內科

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miR-20b對大腸癌細胞增殖和凋亡的影響及其機制的研究

吳巍蕓周宇

作者單位：524001 廣東醫學院附屬醫院消化內科

【摘要】目的探討miR-20b對大腸癌(CRC)細胞增殖凋亡的影響及機制。方法將miR-20b模擬物轉染CRC細胞株HCT-116，qRT-PCR檢測轉染后miR-20b的表達，分別應用CCK-8實驗及流式細胞儀檢測轉染后細胞增殖和凋亡情況。qRT-PCR和western blot檢測轉染后Bcl-w mRNA和蛋白的表達情況。結果轉染miR-20b 模擬物后，HCT-116細胞中miR-20b表達水平明顯上調，HCT-116細胞增殖減弱(P<0.05)，凋亡增強(P<0.05)。miR-20b可作用于Bcl-w mRNA 的3′-UTR，使海腎熒光素酶活性顯著降低。轉染后Bcl-w mRNA及蛋白表達水平明顯下調，差異均有統計學意義(P<0.05)。結論上調HCT-116細胞中miR-20b表達水平，可抑制其靶基因Bcl-w的表達，發揮抑制細胞增殖、增加凋亡的作用。

【關鍵詞】微小RNA；大腸癌；Bcl-w；增殖；凋亡

(ThePracticalJournalofCancer，2015，30:0020～0024)

大腸癌(colorectal cancer，CRC)的發生、發展是多因素參與的過程。原癌基因和抑癌基因的異常表達及其編碼蛋白功能的改變可影響腫瘤發生的多個方面，包括細胞的增殖、侵襲、轉移、血管生成、耐藥以及維持遺傳基因穩定等[1]。微小RNA (microRNA，miRNA，miR)是一類非編碼單鏈小分子RNA，其與靶基因mRNA的3'非編碼末端(3'-UTR)完全和部分互補性結合，從而引起靶mRNA的降解或者阻遏其轉錄后翻譯，與腫瘤[2]、心血管疾病[3]、炎癥[4]等病理生理過程相關。多個研究發現，與正常大腸組織相比，CRC存在多種miRNA表達異常[5-7]。其中基因芯片檢測顯示miR-20b在CRC組織中表達明顯下調[5]，本實驗通過分析miR-20b對CRC細胞的增殖、凋亡的影響及對其潛在靶基因Bcl-w的調控，探討miR-20b在CRC發生發展中的作用。

1材料與方法

1.1主要材料及試劑

人大腸癌細胞株HCT-116購自中國科學院典型培養物保藏委員會細胞庫。轉染試劑lipofectamineTM2000(lipo2000)購自美國Invitrogen公司，Opti-MEM I培養基、RPMI1640培養基、胎牛血清購自美國Gibco公司。人miR-20b 模擬物(mimics)、miRNA-20b mimics陰性對照(miR-20b mimics-NC)購自廣州銳博生物科技有限公司。CCK-8試劑盒購自上海Dojindo公司。Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、小鼠抗人β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔或羊抗小鼠IgG、超敏ECL化學發光試劑盒購自碧云天生物技術有限公司。兔抗人Bcl-w抗體購自美國Santa Cruz公司。 RNAiso Plus、One Step PrimeScript(R)miRNA cDNA Synthesis Kit、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)、SYBR(R)Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)均購自大連Takara公司。TIANGEN高純度質粒小提中量試劑盒購自天根生化科技有限公司。雙熒光素酶報告系統檢測試劑盒購自Promega公司。miR-20b、U6、Bcl-w、β-actin引物由上海生工生物工程公司合成。

1.2細胞培養和轉染

HCT-116細胞用含10%胎牛血清，100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的RPMI 1640培養液，置于37 ℃、含5% CO2的培養箱中常規培養。將HCT-116細胞接種至6孔板，繼續培養24 h待細胞長至60%左右融合時轉染。實驗分為2組：①miR-20b mimics轉染組：使用lipo2000將miR-20b mimics(終濃度100 nmol/L)轉染入細胞；②NC組：使用lipo2000將miR-20b mimics-NC(終濃度100 nmol/L)轉染入細胞。

1.3實時熒光定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測轉染后miR-20b的表達

各組細胞轉染48 h后，用RNAiso Plus提取總RNA。PrimeScript(R)miRNA cDNA Synthesis Kit試劑盒進行miRNA逆轉錄。所得cDNA再使用試劑盒進行PCR反應。miR-20b以U6作為內參。反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，擴增40個循環。qRT-PCR引物序列如下：miR-20b 上游引物，5′-CAAAGTGCTCATAGTGCAGGTAG-3′；U6上游引物，5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；miRNA下游引物Uni-miR、qPCR、Primer包含在逆轉錄試劑盒中。每個反應設3個復孔，miR-20b的相對表達量用2-△Ct法計算。

1.4CCK-8法檢測miR-20b mimics轉染后細胞增殖情況

將HCT-116細胞接種于96孔細胞培養板，按上述分組轉染，分別培養24 h、48 h、72 h、96 h后，每孔更換新鮮培養基200 μl，再加20 μL CCK-8溶液。培養板在培養箱內孵育2 h。用酶標儀測定在450 nm處的吸光度。記錄結果，以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制細胞生長曲線。

1.5流式細胞儀檢測miR-20b mimics轉染后細胞凋亡情況

HCT-116細胞接種于12孔細胞培養板，按上述分組轉染，繼續培養72 h，胰酶消化、收集細胞，PBS洗滌1次，離心后加入Annexin V-FITC室溫避光孵育10 min。離心后棄上清，加入碘化丙啶(PI)染色液，冰浴避光放置30 min。進行流式細胞儀檢測。

1.6雙熒光素酶報告基因檢測

通過TargetScan Human 6.2(http：//www.targetscan.org/)、microRNA.org(http：//www.microrna.org)等常用的生物信息學網站，預測miR-20b的潛在靶基因及其結合位點。PCR擴增包含miR-20b結合位點在內的Bcl-w 3′-UTR序列。將目的序列與雙熒光素酶報告基因載體連接后的質粒轉化入DH5α感受態細胞中，擴增，應用TIANGEN高純度質粒小提中量試劑盒提取質粒。將含預測結合位點的Bcl-w 3′-UTR序列的質粒命名為pmiR-Bcl-w-wt，含Bcl-w 3′-UTR突變序列的質粒命名為pmiR-Bcl-w-mut。將pmiR-Bcl-w-wt或pmiR-Bcl-w-mut分別與miR-20b mimics或miR-20b mimics-NC共轉染HCT-116細胞。培養48 h后，檢測各組海腎及螢火蟲熒光素酶活性，兩者比值進行統計學分析。

1.7qRT-PCR檢測miR-20b mimics轉染后Bcl-w mRNA的表達

各組細胞轉染48 h后，用RNAiso Plus提取總RNA。使用PrimeScript(R)RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒進行mRNA逆轉錄。反應所得的cDNA再使用SYBR(R)Premix Ex TaqTMⅡ (Tli RNaseH Plus)試劑盒進行PCR反應。以β-actin作為內參。反應條件為：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火延伸20 s，擴增40個循環。引物序列如下：Bcl-w上游引物，5′-TTCACCCTACCCTCTACCA-3′；Bcl-w下游引物，5'-AGCCCTTTACCCTTTCAG-3'；β-actin上游引物，5′-GGCGGCA-ACACCATGTACCCT-3′；β-actin下游引物，5′-AGGGGCCGGACTCGTCATACT-3′。

1.8Western blot檢測miR-20b mimics轉染后Bcl-w蛋白的表達

用細胞裂解液裂解細胞并提取細胞總蛋白，BCA法進行蛋白定量后，SDS-PAGE電泳分離總蛋白，電轉移到PVDF膜上，5%脫脂牛奶封閉1 h后，抗Bcl-w抗體(1∶800)及抗β-actin抗體(1∶1000)4℃孵育過夜。TBST洗膜后，加入HRP標記的羊抗兔或羊抗小鼠二抗(1∶1000)室溫孵育1 h，用ECL發光液顯影，X光壓片曝光。應用Quantity One軟件對條帶進行分析。

1.9統計學處理

應用SPSS 19.0統計軟件進行統計學處理。數據以均值±標準差表示，三組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用兩個獨立樣本t檢驗。

2結果

2.1miR-20b mimics轉染后細胞miR-20b表達上調

qRT-PCR結果顯示，與miR-20b mimics-NC轉染組比較，miR-20b mimics轉染組miR-20b表達水平明顯上調，差異具有統計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1　CRC細胞轉染后各組miR-20b的表達情況

2.2過表達miR-20b抑制HCT-116細胞增殖

轉染miR-20b mimics至HCT-116細胞，分別培養24 h、48 h、72 h、96 h后，CCK-8檢測細胞增殖情況。由圖2可見，培養48 h、72 h、96 h時，miR-20b mimics轉染組在450 nm處的吸光度較相應的NC組明顯下降，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖2　CCK-8法檢測兩組細胞增殖情況

2.3過表達miR-20b促進HCT-116細胞凋亡

轉染miR-20b mimics至HCT-116細胞，培養72 h后應用流式細胞儀檢測。miR-20b mimics轉染組Annexin V-FITC單陽性細胞較NC組明顯增加，差異有統計學意義(P<0.05)(圖3)。

2.4雙熒光素酶報告基因檢測

在轉染pmiR-Bcl-w-wt質粒的實驗中，miR-20b mimics組與NC組相比較，海腎/螢火蟲熒光素酶活性下降，兩組比較差異有統計學意義(P<0.05)。在轉染pmiR-Bcl-w-mut質粒的實驗中，miR-20b mimics組與NC組相比較，海腎/螢火蟲熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)(圖4)。

2.5miR-20b mimics轉染后HCT-116細胞中Bcl-w表達水平下調

qRT-PCR檢測結果顯示，與轉染miR-20b mimics-NC組比較，miR-20b mimics轉染組細胞Bcl-w mRNA的表達水平明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)(圖5A)。Western blot檢測結果顯示，與轉染miR-20b mimics-NC組比較，miR-20b mimics轉染組細胞Bcl-w蛋白的表達水平明顯下調，差異有統計學意義(P<0.05)(圖5B和5C)。

3討論

miRNA是近年來發現的一類具有重要調控作用的非編碼小分子RNA。研究發現，多種人類腫瘤，包括CRC，都伴有miRNA的表達異常。miRNA通過靶基因的調控，對腫瘤細胞生物學行為產生影響，在腫瘤的發生、發展過程起作用。Yu等[8]發現，miR-208在人CRC組織中較正常組織表達下降，并與TNM分期、淋巴結轉移、腫瘤分化程度相關，表達低的患者比表達高的患者生存時間更短，說明在大腸癌中miRNA的異常表達與腫瘤的特性和患者的預后相關。miR-154在CRC組織和細胞系中表達降低，過表達miR-154通過作用于其靶基因toll樣受體2(TLR2)，抑制CRC細胞增殖、克隆形成、侵襲、轉移等，發揮抑癌作用[9]。miR-20b與腫瘤的關系也有少量研究。有研究發現，miR-20b在缺氧的微環境下可以降低乳腺癌細胞的血管內皮生長因子表達[10]。基因芯片結果也顯示，miR-20b在CRC組織較正常大腸組織表達下調[5]，但miR-20b如何影響大腸癌的發生、發展呢？本研究發現，轉染miR-20b mimics至HCT-116細胞后，大腸癌細胞HCT-116的miR-20b表達上調，同時細胞增殖明顯受抑，而細胞凋亡率增高，提示miR-20b與CRC細胞的增殖密切相關。

圖3　兩組細胞凋亡圖

以NC組為1，mimics組表示為NC組的倍數。

Bcl-w是 Bcl-2家族抗凋亡成員之一，過表達Bcl-w使細胞凋亡減少。Bcl-w與CRC形成和進展密切相關[11]。在CRC組織中，Bcl-w表達率顯著升高，且與TNM分期和淋巴結轉移有關，提示Bcl-w與CRC的進展有關[12]。張雋等[13]也發現，Bcl-w在大腸腺瘤組織中不表達，而在CRC表達明顯增高，且隨腫瘤浸潤深度增加和淋巴轉移和肝轉移的發生，Bcl-w表達亦增加，同時Bcl-w表達陽性CRC患者預后差，也支持上述Bcl-w與CRC的進展有關的觀點。我們通過生物信息學預測發現Bcl-w是miR-20b潛在的靶基因之一，并進一步通過雙熒光素酶報告基因證實miR-20b能與Bcl-w的3′-UTR結合。轉染miR-20b mimics后，Bcl-w mRNA和蛋白的表達水平均下調，與對照組比較，差異有顯著性，說明在CRC細胞中，miR-20b通過與Bcl-w的3'-UTR結合，調控Bcl-w的表達，進而影響細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，miR-20b在CRC的發生發展中起一定作用，為CRC預防及治療提供新的靶標。但是miRNA的調控機制復雜，一個miRNA不止一個靶基因，因此miR-20b在CRC的功能仍有廣闊的研究前景。

A為兩組Bcl-w mRNA表達情況，B為兩組Bcl-w蛋白表達情況，C為Western blot檢測兩組Bcl-w蛋白表達情況。

圖5miR-20b對HCT-116細胞Bcl-w表達的影響

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(編輯：吳小紅)

Effect of MiR-20b on Proliferation and Apoptosis of Colorectal Cancer Cells and Its Mechanism

WUWeiyun，ZHOUYu.DepartmentofGastroenterology，AffiliatedHospitalofGuangdongMedicalCollege，Zhanjiang，524001

【Abstract】Objective To explore the effect and mechanism of on proliferation and apoptosis of colorectal cancer cells.MethodsAfter transfection of miR-20b mimics into HCT-116 cells，the expression of miR-20b was evaluated by real-time quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (qRT-PCR)，and effect of miR-20b on cell proliferation and apoptosis was determined by CCK-8 assay and flow cytometry，respectively.Bcl-w mRNA and protein was measured by qRT-PCR and western blot.ResultsMiR-20b mimics transfection significantly increased miR-20b expression in HCT-116 cells，inhibited cells proliferation and increased cells apoptosis (P<0.05).MiR-20b could effect on 3′-untranslated region (3′-UTR) of Bcl-w mRNA and decrease renilla luciferase activity.MiR-20b mimics significantly suppressed Bcl-w mRNA and protein level in CRC cells (P<0.05).ConclusionOverexpression of miR-20b in HCT-116 cells may suppress cells proliferation and increase cells apoptosis，probably by downregulating its target gene Bcl-w expression.

【Key words】MicroRNA；Colorectal cancer；Bcl-w；Proliferation；Apoptosis

(收稿日期2014-04-29修回日期 2014-09-30)

中圖分類號：R735.3+4

文獻標識碼：A

文章編號：1001-5930(2015)01-0020-05

DOI：10.3969/j.issn.1001-5930.2015.01.006

通訊作者：周宇