西尼羅病毒感染免疫應答反應研究進展

王化磊，金宏麗，鄭學星，楊松濤，夏咸柱

西尼羅病毒（WestNile virus,WNV）病是由WNV引起的急性發(fā)熱性人獸共患傳染病，可侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)，引起腦炎。病原可被劃分為2個譜系，譜系1流行于非洲中部和北部、以色列、歐洲、印度、澳大利亞、美國中部和北部以及南美洲的哥倫比亞和阿根廷。譜系2主要在非洲中部、南部和馬達加斯加流行。易感宿主包括鳥類、人、馬、蝙蝠、臭鼬、花栗鼠和家兔等多種動物，犬和貓也偶有感染病例。近年來此病在人和動物中暴發(fā)頻繁，給發(fā)病地區(qū)帶來重大經(jīng)濟損失和健康威脅[1]，已被WHO和世界動物衛(wèi)生組織列為全球重大流行病之一。

WNV屬于黃病毒科黃病毒屬日本腦炎病毒族病毒。WNV為單股正鏈RNA病毒，基因組首先翻譯成一個多聚蛋白，進而被宿主和病毒的蛋白酶切割形成3個結構蛋白——衣殼蛋白、囊膜蛋白和前膜蛋白和7個非結構蛋白（nostructural protein,NS）——NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B和NS5。結構蛋白主要參與病毒粒子的形成，NS主要與病毒復制、病毒組裝和誘導宿主的先天性免疫應答相關。

WNV病的發(fā)病過程主要包括3個階段：感染和傳播、外周組織病毒擴散和入侵神經(jīng)系統(tǒng)。動物宿主一旦被帶病毒的蚊子叮咬，病毒首先在皮膚樹突狀細胞（dendritic cells,DCs）內復制，隨后感染細胞轉移至淋巴結，引起首次的病毒血癥，進而感染脾臟和腎臟等器官。病毒血癥擴散至內臟器官后，WNV可通過血腦屏障進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS），感染腦和脊髓，發(fā)展為致命性疾病。目前，WNV進入CNS的機制尚不完全清楚。

老人和免疫缺陷者更容易感染W(wǎng)NV，并易發(fā)展為腦炎。盡管其易感性的免疫原理尚未完全明確，但利用小鼠為感染模型，有關固有免疫和獲得性免疫方面的研究結果表明：在易感人群體內，針對疫苗和保護反應的固有免疫和獲得性免疫功能可能均下降[2]。本文針對WNV感染過程中激發(fā)的固有免疫和獲得性免疫的研究進展進行綜述。

1 固有免疫反應

1.1 固有免疫細胞

1.1.1 巨噬細胞 巨噬細胞可通過直接清除病毒、加強提呈抗原至T和B淋巴細胞、產(chǎn)生促炎或抗病毒細胞因子和炎癥趨化因子等作用限制病毒感染[3]，缺失巨噬細胞的小鼠感染W(wǎng)NV后病情會加重。對于其他黃病毒如日本腦炎病毒，也有報道指出巨噬細胞可通過產(chǎn)生一氧化氮和其他活性氧中間物直接控制感染[4]，但此現(xiàn)象未在WNV感染中得到證實。在WNV感染過程中，巨噬細胞的活化可促進Ⅰ型干擾素（interferon,IFN）、腫瘤壞死因子（tumornecrosis factor,TNF）-α、白細胞介素（interleukin,IL）-1β、IL-8和其他一些細胞因子的釋放，這些分子在體外被證明有抗病毒活性并可降低病毒復制[5]。

1.1.2 DCs 根據(jù)功能和表面分子不同，DCs分為漿細胞樣 DCs（plasmacytoid DCs,pDCs）和髓樣 DCs（myeloid DCs,mDCs）。pDCs無吞噬細胞功能，其捕獲和提呈抗原至T淋巴細胞的效率較低，但在病毒和細菌存在下，pDCs可產(chǎn)生高水平的Ⅰ型IFN，因此在抗病毒免疫過程中有重要作用。WNV感染pDCs后，雖然病毒復制水平較低，但pDCs可快速產(chǎn)生高濃度的促炎細胞因子。這些細胞因子的產(chǎn)生不依賴病毒復制，而是依賴于胞內體Toll樣受體（Toll-like receptors,TLR）7[6]。此外，不同宿主來源的WNV可影響pDCs的應答，例如在哺乳動物細胞中增殖的WNV感染pDCs后可誘導IFNα的產(chǎn)生，而在蚊細胞中增殖的WNV卻不能誘導pDCs產(chǎn)生IFNα[7]。同pDCs相比，mDCs更易感染W(wǎng)NV，一方面可能會促進病毒傳播，另一方面促進免疫系統(tǒng)活化。mDCs在骨髓內產(chǎn)生，分布于全身，作為專職的抗原提呈細胞，可將抗原從外周感染部位運輸至淋巴組織，將感染信號提呈給T和B淋巴細胞，從而快速產(chǎn)生獲得性免疫應答[8]。間接體內試驗（又稱回體法）中，mDCs感染W(wǎng)NV后，可產(chǎn)生強烈的Ⅰ型IFN和促炎細胞因子反應，但mDCs成熟后，其誘導能力下降[9]。有報道表明，缺失CD8α+mDCs后感染W(wǎng)NV時，交叉提呈和病毒特異性CD8+T淋巴細胞反應的能力均喪失[10]。皮膚中DCs亞群可在WNV感染時激發(fā)免疫反應，包括快速動用來源于骨髓的髓樣細胞。

1.2 模式識別分子 宿主細胞可通過模式識別受體（pattern recognition receptors,PRRs）識別病毒表面的病原相關分子模式，進而誘導機體產(chǎn)生抗病毒免疫，包括產(chǎn)生Ⅰ型IFN、IL-1β和促炎細胞因子，表達抗病毒基因，激活固有免疫敏感細胞，促進獲得性免疫的產(chǎn)生等[9]。視黃酸誘導基因蛋白Ⅰ（retinoic acid-inducible gene-Ⅰ,RIG-Ⅰ）樣受體家族［RIG-Ⅰ和黑色素瘤分化相關抗原（melanoma differentiation-associated gene,MDA）5］和 TLR 家族（主要為TLR3和TLR7）是識別WNV的主要PRRs[10]。

RIG-Ⅰ和MDA5是細胞質RNA解旋酶，可識別ssRNA和dsRNA，通過銜接分子（IFN啟動子刺激物-1）傳導信號，激活 IFN調節(jié)基因（IFN regulatory factor,IRF）3和7的轉錄，誘導Ⅰ型IFN和抗病毒基因的轉錄[11]。敲除RIG-Ⅰ的小鼠胚胎成纖維細胞感染W(wǎng)NV后，IRF 3活化明顯延遲，且伴隨著細胞病變和病毒滴度的增加。感染W(wǎng)NV后48 h內MDA5水平會顯著升高，但同對照細胞相比，敲除MDA5的DCs和巨噬細胞感染W(wǎng)NV后，Ⅰ型IFN水平僅有輕微降低，推測MDA5在感應WNV dsRNA時起輔助作用。缺失RIG-Ⅰ和MDA5的接頭蛋白IPS-1后，炎癥反應不可控制，也不能抵抗WNV感染[12]。

TLR3和TLR7為TLR家族成員，主要在胞內體中表達，分別可被dsRNA和ssRNA激活。TLR3可通過活化IRF3和核轉錄因子κB（nuclear factor κB,NF-κB），分別誘導Ⅰ型IFN和炎癥細胞因子的產(chǎn)生。TLR3可參與WNV免疫發(fā)病機制，敲除TLR3的小鼠腹腔感染W(wǎng)NV后，外周病毒滴度增加，抗病毒和促炎細胞因子減少，小鼠死亡率降低。推測敲除TLR3后，可能由于外周炎癥反應水平降低（TNF-α降低，而TNF-α可影響血腦屏障的完整性），血腦屏障保持完整性，進而阻礙病毒侵入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，因此小鼠存活率增加[13]。TLR7通過胞內接頭蛋白髓樣分化因子88（myeloid differentiation primary response gene 88,MyD88）進入信號通路活化階段，活化IRF7和Ⅰ型IFN。就理論而言，TLR7和依賴IL-23的反應可調控免疫細胞到達被感染的細胞。敲除TLR7的小鼠和巨噬細胞感染W(wǎng)NV后，IL-12和IL-23反應降低，易發(fā)展為致死性西尼羅腦炎[14]。此外，皮膚感染后，TLR7介導的反應可促進朗格漢斯細胞的遷移[15]。

1.3 IFN 在病毒感染過程中，Ⅰ型IFN（包括IFN α和IFNβ）由WBC和實質性細胞分泌生成，在天然免疫反應中發(fā)揮重要作用[16]，可通過上調與抗病毒有關的基因，誘導抗病毒免疫，還可刺激DCs細胞成熟和直接激活B和T淋巴細胞[17]。小鼠體內或體外細胞培養(yǎng)物的實驗表明，Ⅰ型IFN可在WNV感染早期通過阻止病毒復制和保護神經(jīng)元控制病毒感染。細胞識別WNV后，可通過TLR3和TLR7受體產(chǎn)生Ⅰ型IFN，進而活化接頭蛋白MyD88和轉錄因子IRF3和IRF7。在病毒感染早期，WNV RNA通過激活RIG-Ⅰ和MDA5，可誘導Ⅰ型IFN的產(chǎn)生[18]。人mDCs、pDCs和單核細胞來源的巨噬細胞感染W(wǎng)NV后，可分泌Ⅰ型IFN[7]。缺失IFNα/β受體的小鼠對WNV高度易感，病毒很快傳入CNS內，導致100%的小鼠死亡[19]。此外，在Vero細胞中，提前或之后作用Ⅰ型IFN后，均可抑制WNV復制[20]。在小鼠原代神經(jīng)元感染W(wǎng)NV之前或之后使用IFN β可通過干擾病毒復制，增加神經(jīng)元的存活幾率[19]。

Ⅱ型IFN（如IFNγ）主要由CD8+T淋巴細胞產(chǎn)生，也可由γδT淋巴細胞和自然殺傷細胞產(chǎn)生，可能在WNV感染的早期固有免疫中起作用。體內實驗表明，IFNγ可在病毒感染早期限制WNV擴散進入CNS，敲除IFNγ或IFNγ受體基因的小鼠，其病毒血癥加重，外周淋巴組織中病毒復制增加，病毒進入CNS的能力增強，致死率升高[21]。

近年來，第三種IFN被提及。以前命名為IL-28a/b和IL-29，后被歸類為 IFN λ[16]。IFN λ3可作為重要的細胞因子控制黃病毒如HCV的感染[22]，但在其他黃病毒中IFNλ的作用研究較少，與WNV相關的文獻僅有1篇。同Ⅰ型IFN作用相似，IFNλ可阻止WNV病毒樣粒子（經(jīng)基因改造的WNV，僅可進行單周期感染）感染易感細胞，但如果提前加入IFNλ，則不能抑制病毒復制[23]。

2 獲得性免疫反應

2.1 體液免疫反應 機體抵抗WNV感染的過程中，體液免疫發(fā)揮關鍵性作用。B淋巴細胞缺陷小鼠感染W(wǎng)NV后，其CNS內可檢測到高滴度的病毒，并可引起小鼠100%死亡[24]，這可能與機體不能有效清除外周的病毒有關。機體感染W(wǎng)NV后，固有免疫活化B淋巴細胞的過程須通過Ⅰ型IFNα/β受體的信號通路，此通路是在淋巴竇中實現(xiàn)，而不是在脾中實現(xiàn)[25]。研究表明，缺失MyD88的小鼠在感染W(wǎng)NV后，小鼠體內B淋巴細胞活化、生發(fā)中心激活和記憶性B淋巴細胞反應等方面均有缺陷[26]。多種基因缺陷會影響抗病毒抗體的活化、產(chǎn)生和運輸，從而導致抗體滴度和存活率下降[27]。

小鼠感染W(wǎng)NV后，其腦內漿細胞會增加[28]，可能是與CNS內IgG發(fā)揮抗病毒作用有關。將具有中和活性的單克隆抗體或多克隆IgG注射正常小鼠，

可抵抗WNV的致死性攻擊，如果注射μMT小鼠，可延長其存活時間[29]，但在WNV感染初期，抗體起的作用未知。為了評價抗體療法的可能性，μMT小鼠感染病毒2 d后注射人丙種球蛋白，小鼠存活時間增加。喪失分泌IgM功能的小鼠（sIgM－/－小鼠，但細胞表面可表達IgM），感染W(wǎng)NV后會全部死亡[29]。將抗WNV IgM抗體（免疫后4 d獲得）或抗WNV IgG抗體被動轉移入正常小鼠或sIgM－/－小鼠體內，可限制病毒的擴散。因此，早期的抗WNV IgM抗體反應可限制病毒在外周和CNS內的傳播，且在感染后4 d體內IgM水平可預測存活結果[30]。

2.1.1 記憶性免疫應答 感染W(wǎng)NV后[24]或免疫預防[31]時，特異性IgG的產(chǎn)生極其重要。然而WNV感染時，有關記憶性應答反應的研究較少。免疫小鼠體內，記憶性B淋巴細胞（memory B cells,MBCs）和長壽命漿細胞（long－lived plasma cells,LLPCs）可長期存在，并在再次感染時發(fā)揮保護作用[32]。感染消退后，LLPCs主要存在骨髓中，持續(xù)分泌高親和抗體，且抗體是針對初次感染時病毒E蛋白的免疫顯性表位。然而，MBCs不僅可識別免疫顯性表位，還可識別突變的免疫表位。因此，WNV突變株可能會逃逸高親和力的LLPCs抗體的識別，而MBCs產(chǎn)生的抗體則可能會對突變株有中和作用。近期研究表明，將已免疫日本乙型腦炎病毒小鼠的MBCs被動轉移至未免疫小鼠體內，可保護后者抵抗致死性WNV的攻擊[33]，證明在黃病毒感染時，MBCs可提供交叉保護作用。缺失TLR3的小鼠免疫WNV時，MBCs的產(chǎn)生未受影響，但對生發(fā)中心和LLPCs有負面影響[26]。

2.1.2 針對WNV特異性表位的免疫應答 WNV的E蛋白含有中和抗體的主要識別位點。已知的抗體表位有3段：結構域Ⅰ－結構域Ⅲ（domainⅠ－domain III,DⅠ－DⅢ）。其中，不連續(xù)的DⅢ表位可刺激機體產(chǎn)生有效的中和抗體[34]。E16是一種被廣泛研究的DⅢ－LR單克隆抗體，其在皮摩爾濃度下即具有中和WNV的能力[35]。除E蛋白外，也進行了針對WNV其他蛋白抗體的研究。有感染性的WNV粒子含有未裂解的prM，在小鼠和人的抗WNV免疫血清中，均可檢測和分離到抗prM抗體[36]，但抗prM抗體在體內中和活性較差，保護能力較低[37]。體外實驗證明抗NS1特異性抗體有保護活性[38]，推測NS1抗體可與被感染細胞表面表達的NS1結合，通過與巨噬細胞表達的Fc－γ受體作用，導致感染細胞被吞噬[39]，因此可考慮使用針對NS1的單克隆抗體作為預防藥物。此外，也存在針對NS3、NS5[40]和衣殼蛋白[41]的抗體反應，但在保護機體對抗病毒感染過程中擔任的角色尚不明確。

2.2 細胞免疫反應 單獨被動轉移抗體入重組激活基因（recombination activating gene,RAG）缺陷小鼠（缺失B和T淋巴細胞）體內，不能充分保護小鼠，只能延遲死亡；胸腺輸出的初始T淋巴細胞如果減少，會導致初次應對WNV感染時反應能力下降[42]。研究表明，T淋巴細胞介導的細胞免疫在病毒清除中也具有重要作用[30]。

WNV感染CD4+T淋巴細胞缺陷的小鼠后，病毒在其CNS內存留的時間延長，導致小鼠在感染后50 d死亡[43]。感染后15 d，缺陷小鼠體內WNV特異性IgM水平是正常小鼠的1/20，IgG水平是正常小鼠的1/1000～1/100，且特異性CD8+T淋巴細胞的活化和進入CNS內的數(shù)量明顯下降[43]。因此，在首次感染W(wǎng)NV時，CD4+T淋巴細胞的作用是輔助抗體反應并維持特異性CD8+T淋巴細胞反應，以有利于CNS內病毒的清除。

CD8+T淋巴細胞在控制WNV感染中有直接作用[44]。缺失CD8+T淋巴細胞或經(jīng)典的Ia型主要組織相容性復合物抗原的小鼠感染致病性WNV時，CNS內可檢測到高滴度病毒，且死亡率增加[45]。值得一提的是，缺失CD8+T淋巴細胞的小鼠首次感染W(wǎng)NV時，抗體產(chǎn)生數(shù)量正常，病毒血癥的動力學和程度也無影響，但存活小鼠的CNS內仍有病毒存在，且可持續(xù)數(shù)周。盡管抗體數(shù)量正常，且已證明IgM和IgG在阻止WNV進入CNS過程中有重要作用[29]，但WNV仍可進入大腦，說明CD8+T淋巴細胞在免疫清除病毒過程中有重要功能。

3 小 結

WNV病廣泛流行于世界多個地區(qū)，對公共衛(wèi)生安全有極大威脅[46]，因此開展WNV病的預防和治療研究意義重大。為此，須首先闡明機體對抗病毒產(chǎn)生的免疫反應機制。現(xiàn)已有許多關于WNV感染時機體免疫應答的研究，但仍有許多問題有待解決[34]，例如：病毒蛋白、RNA元件和非編碼RNA在調節(jié)固有免疫反應中的作用；病毒被免疫系統(tǒng)識別或逃逸免疫系統(tǒng)監(jiān)視的機制；IgG在初次感染病毒時起的作用；抗prM抗體在感染中的作用；早期活化B淋巴細胞的信號有哪些；WNV進入CNS的機制等。此外，大部分研究是以小鼠為模型建立的，在鳥類體內的免疫反應同哺乳動物體內是否相同，以及免疫反應如何影響疾病的發(fā)展尚不明確。也有證據(jù)表明，不同種類鳥體內免疫反應的不同會影響WNV感染的結果[47]。總之，WNV感染后機體的免疫反應是多因素共同作用的結果，深入了解其中的各個環(huán)節(jié)有利于加深我們對免疫反應的理解，也可為如何提高免疫反應、研制新型疫苗奠定基礎。

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