埃博拉病毒免疫學致病機制研究進展

劉 賽，張永宏

2014年2月起暴發的西非埃博拉病毒病（Ebola virusdisease,EVD）疫情，截至2015年1月4日確診或疑似病例已有20 747例，其中8235人喪生[1]。2014年8月8日，WHO宣布本次EVD疫情已經成為國際公共衛生緊急狀況。本病目前尚無特異性治療方法，亦無有效疫苗。因此，人體對于埃博拉病毒（E－bola virus,EBOV）的免疫反應可謂是對抗本病的最主要途徑，也是發現有效治療方法和開發疫苗的關鍵。因此，本文就EBOV屬的免疫學致病機制進行綜述。

1 病原學、流行病學和臨床特點

本病病原為EBOV，屬于纖維病毒科纖維病毒屬，為單股負鏈RNA病毒，RNA不分節段。病毒呈纖維狀，可呈桿狀、絲狀、“L”形等多種形態。病毒顆粒長度平均1000 nm，直徑約100 nm。病毒有脂質包膜，包膜上有呈刷狀排列的突起，主要由病毒糖蛋白組成。EBOV可分為扎伊爾型、蘇丹型、本迪布焦型、塔伊森林型和萊斯頓型。除萊斯頓型僅有非人類靈長類動物致死記錄外，其余4種亞型感染人類后均可致病（塔伊森林型僅有1例人類致病記錄）。不同亞型病毒基因組核苷酸構成差異較大，但同一亞型的病毒基因組相對穩定。

EBOV主要傳染源是感染EBOV的人和非人類靈長類動物，目前認為其自然宿主為狐蝠科的果蝠，但其在自然界的循環方式尚不清楚。本病最主要的傳播途徑是接觸傳播，可以通過接觸患者和被感染動物的各種體液、分泌物、排泄物及其污染物感染，而患者感染后血液中可保持很高的病毒載量，如未能做好防護和隔離，易造成醫院內傳播，因此其為EVD暴發流行的重要因素。

本病潛伏期為2～21 d，一般為5～12 d。尚未發現本病在潛伏期有傳染性。自然病程內常見癥狀為發熱、惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、膚色改變、全身酸痛、出血等，感染者癥狀與同為纖維病毒科的馬爾堡病毒感染癥狀極為相似。致死原因主要為心肌梗塞、低血容量性休克及多器官衰竭。主要病理改變為皮膚、黏膜和臟器的出血，多器官可見到灶性壞死。肝細胞點和灶樣壞死是本病的典型特點，可見小包涵體和凋亡小體。目前對EVD尚缺乏特效治療方法，主要是對癥和支持治療。

2 免疫學致病機制

接觸感染性的體液或組織時，EBOV可通過損傷的皮膚或針刺傷口進入人體[2]。在易感動物模型中，有證據證明病毒可經由氣溶膠方式經黏膜感染機體[3]。

病毒進入人體后，早期即可進入單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞（dendritic cells,DCs）復制，并誘發細胞因子和趨化因子的釋放。病毒還可與這些細胞表面的凝集素受體結合，隨這些細胞散播。體內試驗顯示出感染后髓樣細胞觸發受體1的快速表達，這將會導致細胞因子和趨化因子進一步釋放[4]。同時單核細胞和巨噬細胞會過度表達細胞表面組織因子，促進凝血異常發生[5]。一項研究發現病死者血病毒載量往往達到1010copies/ml，而幸存者血病毒載量常常約為107copies/ml，提示病毒復制直接導致組織損傷也是疾病致死的重要一環[6]。

單核細胞和巨噬細胞感染后將大量分泌促炎性細胞因子和趨化因子，包括腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor,TNF）－α、白細胞介素（interleukin,IL）－1、巨噬細胞炎性蛋白質（macrophage inflammatory protein,MIP）－1α及活性氮氧自由基，導致以正反饋形式募集更多單核細胞和巨噬細胞以及中性粒細胞至感染部位，并促進血管通透性增加及血管擴張[6]。病毒顆粒可誘導多形核細胞脫顆粒，加劇這種早期炎癥反應，并激活這些多形核細胞。這樣的早期炎癥反應未必是完全有害的，它也有可能在早期幫助機體建立好的免疫反應趨勢甚至免疫適應過程。扎伊爾型EVD病死者血清可檢測到IL－1β、IL－1RΑ 、IL－6 、IL－8 、IL－15、IL－16、MIP－1α、MIP－1β、單核細胞趨化蛋白－1、巨噬細胞集落刺激因子、巨噬細胞抑制因子、誘導蛋白－10、生長調節癌基因蛋白－α及嗜酸細胞活化趨化因子顯著上升；存活者血清僅可測及 IL－1β、IL－6、MIP－1α 和 MIP－1β暫時性中度上升。蘇丹型EVD病死者血清僅見IL－1β、IL－6、MIP－1α 和 MIP－1β 顯著上升，其余細胞因子無明顯變化；存活者中僅見干擾素（interferon,IFN）α上升。本迪布焦型EVD病死者中，可見IL－10顯著上升，而 IL－1α、IL－1β、IL－6 和 TNF－α 水平反而下降；存活者中未見細胞因子水平有異常變化[7－10]。

另外，IFN在抗病毒和保護機體中起到重要的作用。而多項研究表明EBOV有減少IFN分泌以及阻斷其作用通路的能力，因此對以DCs為主的多種免疫細胞的功能有巨大的影響，同時阻斷了固有免疫和獲得性免疫之間的重要通路。小鼠實驗發現，本來對本病毒有高度抵抗能力的小鼠敲除IFNα/β受體或信號轉導與轉錄激活子（signal transducer and activator of transcription,STAT）1或注射IFN抗體后會對本病毒易感，提示IFN為重要保護性因子[11]。現已發現2種病毒編碼的蛋白——VP24和VP35，能影響IFN的作用[12－14]。VP24干擾STAT1的核聚集，以此阻斷Ⅰ型IFN通路，導致被感染機體免疫系統對這一具有抗病毒作用的信號轉導通路不敏感[13]。VP35阻斷IFN調節因子－3，減弱IFN反應，同時減少 IFN α/β 生成[12,14－15]。因此，感染后的DCs不會分泌IFNα，也無法被完全激活成熟，同時Ⅰ型主要組織相容性復合體（major histocompatibility complex,MHC）表達下降。此外，IFN分泌減弱會導致自然殺傷細胞（natruralkiller cell,NK細胞）和iNKT細胞激活減弱[16]。已有研究指出，在小鼠體內實驗中，敲除或用抗體阻滯NK細胞可導致小鼠對本病抵抗能力下降，可見NK細胞是一個重要的保護因素。

如前所述，DCs在感染過程中，尤其在死亡患者中，會出現Ⅰ型MHC表達下降以及抗原提呈能力嚴重下降的現象，提示獲得性免疫同樣會被削弱。現有觀點認為病毒通過淋巴系統作為轉運媒介，散播并感染內皮細胞及多種肝、肺和脾細胞，以利于進一步復制和傳播[6，17]。然而病程稍早期可見淋巴細胞大量凋亡，這構成疾病致死過程的重要一環[18－20]。一項研究指出，多種分子機制促發這個現象，包括TNF相關凋亡誘導配體和Fas－FasL[18]。然而具體的機制仍在研究中，現有研究指出受感染的巨噬細胞分泌的一氧化氮可誘導凋亡的發生，而功能不全的DCs和整體上的免疫抑制狀態加劇促發了這種現象[20]。

關于獲得性免疫具體機制方面，在體液免疫環節中，病毒編碼的EBOV糖蛋白（glycoprotein,GP）不僅幫助病毒出芽釋放，還具有表位偽裝和原子空間遮蓋的作用。GP表面被大量N－和O－連接寡糖和唾液酸覆蓋，幫助它達成以上2項功能[21－22]，使得中和抗體難以識別病毒特異性表位以中和病毒，抗原提呈細胞也因為抗原被遮擋以至于難以識別病毒抗原。

值得一提的是，病毒GP基因不僅編碼GP，尚編碼一種非病毒結構性的分泌性GP（secretory GP,sGP），其與GP共享一些抗原表位。前期研究曾懷疑sGP在細胞層面上有直接的免疫病理作用，如結合中心粒細胞，誘導淋巴細胞凋亡，增加血管通透性等功能，后續研究已將這些觀點推翻[23－24]。近期研究主要集中在其于體液免疫中的角色和其對疫苗研發的影響。在轉錄水平上，sGP與GP產生定量比率約為2.8∶1，然而sGP為二聚體，GP為三聚體，再經過轉錄后修飾等環節，最終血漿中二者豐度比率為4.4∶1，考慮到二者共享部分抗原表位，高度提示sGP會大量結合GP抗體，致其滴度下降。研究中還發現，以GP作為免疫原免疫的動物模型中，一旦以sGP刺激，則抗GP效應下降，推測因為共享表位的存在，即便是以GP為免疫原免疫實驗動物，實驗動物體內仍會產生少量針對sGP表位的免疫細胞。一旦以sGP刺激后，大量擴增的sGP特異性免疫細胞會在數量上與GP特異性免疫細胞競爭，以至于危害GP特異性免疫細胞的存在[25－26]。因此可以推測，經GP源性疫苗免疫后的人類，可能在感染EBOV后，因sGP大量增生，而使免疫效果大打折扣。

盡管如此，利用生物工程技術，以不同病毒包裝的GP疫苗能不同程度地誘導病毒特異性T和B淋巴細胞反應。經分析其血清抗體水平與生存率呈正相關，結合疫區將幸存患者血清用于后續出現的EVD患者這種療法的成功經驗，使部分研究者將目光投向體液免疫環節。前期試驗包括使用KZ52單克隆抗體或其他多克隆抗體作為預防性或治療性疫苗的最終效果并不如人意，推測可能是由于前述sGP抗體耗竭或GP抗原表位遮蓋等作用[27－28]。然而類似于抗HIV的高效抗反轉錄病毒療法，有研究使用3種表型無重疊的病毒特異性抗體（ZMAb）注射入已感染非人類靈長類動物，發現其有明顯的保護性作用[29]。后續研究中發現，發病13周再次注射病毒后，6只動物中有2只死亡。研究2只死亡動物血樣發現，其中缺乏CD4+IFNg+GP特異性T淋巴細胞，顯示其未能建立特異性的病毒免疫記憶反應[30]可能與這種機制有很大關系。這也激勵醫學界深入關注多價單克隆抗體療法對于本病的治療作用，并且催生了ZMapp這種治療性藥物（即ZMAb和MB－003的合劑）的研發。近期的研究更是將ZMAb原理和其他藥物（尤其基于上述免疫致病環節中的關鍵因子）聯合，探討其治療作用。一項研究聯合ZMAb和腺病毒載體的IFNα（Ad－IFN）治療感染EBOV的實驗動物，探討其在病程不同階段對短尾猴和恒河猴的治療作用。研究發現，75%的短尾猴（感染后第 3天注射 Ad－IFN和 50 mg/kg的ZMAb）、50%的短尾猴（感染后第1天注射Ad－IFN，感染后第 4天注射 50 mg/kg的 ZMAb）和100%的恒河猴（感染后第3天注射Ad－IFN和50 mg/kg的ZMAb）獲得病毒清除性存活（截至感染后第 28天）[31]。

至于主動免疫方面，多數研究所關注的特異性抗原表位主要也是GP。一項研究發現，利用扎伊爾型EBOV的GP上的MFL片段（氨基酸殘基393～556），能誘導出較強的免疫反應，產生大量中和抗體。使用重組VSV載體制備的二價蘇丹型EBOVGP及MFL片段疫苗可于小鼠體內誘導出抗扎伊爾型和蘇丹型EBOV的交叉免疫力，并產生大量中和抗體[32]。另一項疫苗實驗中（同樣以VSV為載體，EBOV－GP為抗原），免疫后的小鼠（VSVΔG/EBOV－GP疫苗劑量2×104空斑形成單位）中，在不同時間節點使其感染小鼠適配的EBOV，6.5個月和9個月的生存率均為100%，12個月的為80%（12/15）。以其免疫豚鼠后（劑量2×105空斑形成單位），在不同時間節點使其感染豚鼠適配的EBOV，7個月的生存率為83%（5/6），12個月和18個月的均為100%。經分析實驗數據得出，實驗動物感染前，其血漿內仍存在EBOV－GP特異性IgG與生存率呈正相關[33]。

有幾項研究結果則支持細胞免疫在獲得性免疫中的地位。研究顯示，CD4+T淋巴細胞、CD8+T淋巴細胞和B淋巴細胞各自缺失的3組小鼠被注射病毒后，僅CD8+T淋巴細胞缺失組無小鼠存活，提示CD8+T淋巴細胞在細胞免疫過程中起到巨大作用[34－37]。另一項類似的靈長類動物實驗中，以基于腺病毒的特異性疫苗主動免疫實驗動物后，將其產生的特異性IgG濃縮后輸入未免疫的同種動物時，僅能保護5只中的1只，而利用抗體消減已主動免疫的動物的CD8+T淋巴細胞后，5只中的4只免疫保護作用消失，而存活的1只血樣中CD4+T淋巴細胞水平在5只中是最高的[38]。這不僅說明CD8+T淋巴細胞具有保護性作用，也從側面反映出個體獲得性免疫功能中各免疫細胞及其功能的平衡十分重要。

3 展 望

本次EVD疫情與以往有幾點明顯的不同：首先，本次疫情可謂是一次國際性疫情，不僅影響到西非多個國家，尚有病例輸出到歐洲及美洲，造成全球性恐慌。然而也正是如此，吸引了國際醫學界的廣泛關注，以及政府等部門的大力投入。此外，值得注意的是，本次疫情流行毒株為致病性和病死率最高的扎伊爾型EBOV，然而，截至目前所有病例病死率為39.7%（根據WHO截至2015年1月4日報告的病例數[1]），遠遠低于既往疫情的50%～90%[39]，提示醫療經驗累積和支持療法的進步可能與本病病死率下降有關。在科研方面，對于免疫致病機制的研究和疫苗的研發有了長足進展[40－41]，尤其是特異性抗原表位多價單克隆抗體與補充病理狀態下缺乏的因子相結合的靶向療法在動物實驗中顯示出相當的治療作用，為本病特異性療法的開發帶來了曙光。同時，主動免疫方面的研究肯定了多價疫苗的免疫保護效果，已具備Ⅱ期臨床試驗的條件。因此，在這種國與國之間、臨床與科研之間協同合作的總體環境下，相信攻克EVD的戰役擁有美好的明天。

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