西方馬腦炎疫苗研究進展

王 超，金宏麗，王化磊，楊松濤，夏咸柱

西方馬腦炎（western equine encephalitis,WEE）是由西方馬腦炎病毒（western equine encephalitis virus,WEEV）感染引起，經蚊蟲傳播的急性人獸共患病毒性疾病。該病具有傳染性強、發病率及病死率高等特點。WEEV于1930年首次從美國加州默克郡的病馬腦內分離，目前WEE主要分布于北美洲的加拿大、美國以及南美洲的巴西、阿根廷、墨西哥、秘魯、智利和烏拉圭等國。此病在北美呈地方性流行，以不規則的間隔時間在馬和人群中流行[1]。我國于1990年首次從新疆維吾爾自治區烏蘇縣的赫坎按蚊和博樂縣的全溝硬蜱中分離到WEEV[2]。呂新軍等[3]在我國青海省、甘肅省、黑龍江省、河南省、湖北省、安徽省、湖南省、寧夏回族自治區及新疆維吾爾自治區進行人體血清調查，發現除寧夏回族自治區、黑龍江省和湖北省未發現WEEV抗體陽性血清外，其余地區均存在WEEV抗體陽性血清，WEEV抗體陽性率達到2.71%。最近幾年我國多地出現不明原因腦炎病例，疑與WEEV有關，提示WEEV存在于我國，且有暴發流行的可能。

因WEEV感染人和馬后可導致極其嚴重的負面影響，受感染的人和馬也存在跨國傳染的可能性[4]，在全球引起了廣泛關注，發生疫情后必須向世界動物衛生組織申報[5]。此外，WEEV被視為一種潛在的生物戰劑（生物恐怖劑）[6-7]。目前WEE尚無獲批疫苗或有效抗病毒藥物，研發有效疫苗用于相關人群的免疫預防顯得尤其重要。本文就疫苗研究進展進行綜述。

1 滅活疫苗

目前，基于福爾馬林滅活WEEV制備的滅活疫苗是一種試驗中新藥，僅適用于馬和實驗室工作人員的預防免疫[8]。長期試驗表明：3次免疫后僅有50%的個體產生了有效免疫應答，且免疫后1年僅有20%的個體仍存在特異性免疫力，因此易感人群須每年進行加強免疫[9]。雖然該滅活病毒疫苗免疫效果良好，但是生產過程中病毒的大量繁殖須在生物安全3級實驗室進行，此過程存在操作人員被WEEV感染的風險，導致疫苗生產成本居高不下，因此該疫苗的應用受到限制[5]。

2 減毒活疫苗

目前尚無減毒活疫苗獲批上市，WEEV弱毒株的篩選處于研究階段。有報道利用反向遺傳技術，將WEEV的全長cDNA進行定點突變，拯救獲得了減毒的突變毒株（WE2102和WE2130）。動物實驗結果表明，與母本毒株相比，減毒株在蚊體內的復制和傳播能力明顯降低，免疫1日齡小雞2周后以WEEV強毒株進行攻擊，未出現病毒血癥，WE2102和WE2130可作為減毒疫苗候選株[10]。

曾有一種與WEEV同屬的委內瑞拉馬腦炎病毒的減毒疫苗獲批在人和馬中使用，但臨床應用結果表明，盡管該疫苗能夠誘導機體產生持久的保護性免疫，但近40%的疫苗接種者出現不同的不良反應。此外，考慮存在神經毒性等不安全因素，該減毒疫苗在美國已停止使用[11]。

3 亞單位疫苗

Das等[12]利用大腸桿菌表達WEEV的E1蛋白，該重組蛋白免疫小鼠后可產生較強的特異性細胞免疫和體液免疫應答，但同源WEEV攻擊的保護率僅為25%，且對異源病毒株的攻擊無保護力。此外，該研究組又采用大腸桿菌表達了WEEV的E2蛋白，盡管E2蛋白免疫小鼠的同源WEEV攻擊保護力略高于E1蛋白，但整個實驗結果與E1蛋白的結果無顯著差異[13]。

近來，也有研究嘗試采用桿狀病毒表達系統表達WEEV糖蛋白以制備WEE亞單位疫苗。Toth等[14]分別構建了表達不同WEEV糖蛋白（整個E1蛋白、E1蛋白結構域、E26KE1多聚蛋白前體和E2-E1嵌合蛋白）的重組桿狀病毒，并同時研究不同桿狀病毒啟動子對誘導目的蛋白表達的影響。結果表明，目的蛋白的性質和啟動子的類型均會影響重組蛋白表達的產量和質量。采用桿狀病毒表達系統制備的這些重組蛋白的免疫保護效果尚待動物實驗進行評價。

4 嵌合體疫苗

近年來，辛德畢斯病毒（sindbis virus,SINV）被成功用作表達高致病性甲病毒屬腦炎病毒結構蛋白的表達載體。Atasheva等[7]利用SINV載體首先構建了第一代嵌合體病毒SIN/CO92，其結構蛋白來自WEEV CO92-1356株，非結構蛋白均來自SINV AR339株。嵌合重組病毒可在哺乳動物和蚊蟲細胞內高效復制，并對6周齡小鼠無致病性。動物免疫實驗顯示：高劑量（5 log10PFU）的SIN/CO92嵌合體病毒免疫小鼠能有效抵抗致死劑量的WEEV攻擊，低劑量（≤4.5 log10PFU）嵌合體病毒免疫時其保護率為50%～60%。此外，Atasheva等[7]還構建了第二代嵌合體病毒IN/SIN/McM和SIN/EEE/McM，其結構蛋白來自WEEVMcMillan株，但其編碼RNA結合結構域的衣殼蛋白N-末端則分別來自SINV或東方馬腦炎病毒（eastern equine encephalitis virus,EEEV）FL93-939株，非結構蛋白均來自 SINV AR339株。安全性和免疫原性實驗結果顯示，部分小鼠在SIN/SIN/McM嵌合體病毒免疫后發病并死亡，提示該嵌合體病毒毒力強；與此相反，SIN/EEE/McM嵌合體病毒則呈現出高免疫原性和弱毒性，而且WEEV攻擊后的免疫小鼠保護率為100%。

Schoepp等[15]采用反向遺傳技術，拯救獲得了重組WEEV和EEEV的嵌合體病毒。該嵌合體病毒基因組5'末端的2/3來自于WEEV，編碼非結構蛋白；3'末端的1/3來自于EEEV，編碼結構蛋白。與母本病毒（WEEV和EEEV）相比，該嵌合體病毒的毒力顯著降低，其免疫小鼠后可有效抵抗致死劑量的EEEV攻擊，但不能抵抗致死劑量的WEEV攻擊。

5 重組活載體疫苗

5型人腺病毒（human adenovirus type 5,HAd5）載體也被應用于WEE新型疫苗的研究。Wu等[16]利用HAd5載體構建了表達WEEV 71V-1658株E3-E2-6K-E1結構蛋白的重組病毒Ad5-WEEV。小鼠實驗結果表明：Ad5-WEEV免疫小鼠1次不僅可100%抵抗致死劑量的同源WEEV（71V-1658株）攻擊，還可有效抵抗致死劑量的異源病毒（CBA87）攻擊。此外，1次免疫后13周，免疫小鼠仍具有有效抵抗力。Ad5-WEEV可作為WEE暴發或WEEV生物襲擊時的候選應急疫苗[6]。然而，作為重組活載體疫苗，人體內已經存在的腺病毒抗體產生的抗載體免疫以及腺病毒本身的安全性仍須進一步評價。

6 DNA疫苗

Nagata等[17]制備了表達WEEV 71V-1658株結構蛋白（C-E3-E2-6K-E1）的DNA疫苗pVHX-6。4次免疫后，同源病毒株攻擊時免疫小鼠受到100%保護，然而該疫苗對異源病毒株的攻擊僅能提供50%～62%的保護。進一步研究表明，該DNA疫苗免疫不能誘導機體產生高水平中和抗體，但能誘導產生較強的E1和E2抗原特異性T細胞免疫應答。

為進一步研究pVHX-6的哪一種編碼蛋白與保護性免疫相關，Gauci等[18]構建了pE3-E2-6K-E1、pE3-E2和p6K-E1 3種不同的DNA疫苗。動物實驗結果顯示：3次免疫后，p6K-E1、pE3-E2-6K-E1和pVHX-6免疫小鼠抗同源病毒株的保護率為100%，當用異源病毒株CBA87攻擊時僅部分免疫小鼠受保護；用異源病毒株Fleming攻擊時，pE3-E2-6K-E1免疫小鼠的保護率為100%，pVHX-6免疫小鼠為50%，p6K-E1免疫小鼠為0。此外，pE3-E2免疫小鼠對WEEV同源病毒株或異源病毒株的攻擊均無保護力。其免疫保護缺失的原因可能是因為6K基因片段的缺失，而這個基因片段對于蛋白的正確折疊起著至關重要的作用。

7 小 結

隨著免疫學和分子生物學技術的飛速發展，研究者不斷嘗試開發新型WEE疫苗，且許多疫苗已在小鼠模型中被證實安全有效，在下一步進入人體試驗前可先用馬模型進行評價。近年來，WEE不僅在北美廣泛傳播，而且正在歐洲國家逐步擴散，加之存在的WEE跨國傳播和我國存在WEE暴發流行的可能性，我國WEE新型疫苗的研究迫在眉睫。

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