腦囊尾蚴病動物模型研究進展

陳小華，于 璇，郭建勛

腦囊尾蚴病（nuerocysticercosis,NCC）是由豬帶絳蟲幼蟲（囊尾蚴）感染人中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system,CNS）引起的寄生蟲病，是人體囊尾蚴病之一，也是最常見的CNS寄生蟲病之一。該病是社區(qū)獲得性活躍癲疒 間的最常見原因，在包括印度和拉丁美洲在內(nèi)的發(fā)展中國家，26.3%～53.8%活躍的癲疒 間病例是由NCC引起[1]。由于流行區(qū)患者遷移活躍和（或）鉤絳蟲攜帶者頻繁旅游或公務(wù)旅行到發(fā)達國家，導(dǎo)致近年在北美洲、歐洲和澳大利亞等發(fā)達國家再次出現(xiàn)NCC病例[1－2]。囊尾蚴病為我國北方主要的人獸共患寄生蟲病，既往在我國東北、華北和西北地區(qū)多見，現(xiàn)發(fā)現(xiàn)其流行和分布遍及全國各地，且發(fā)病數(shù)呈不斷上升趨勢[3]。研究囊尾蚴病的發(fā)病機制、病理變化、宿主免疫反應(yīng)和藥物療效，對人體囊尾蚴病尤其是對NCC的控制顯得尤為重要。

早期無癥狀NCC表現(xiàn)為很少或無炎癥狀態(tài)，而隨后發(fā)生的有癥狀NCC則是由囊尾蚴降解導(dǎo)致的強烈炎癥反應(yīng)所致。這些漸進性的過程及其參與機制很難在人體內(nèi)進行研究，因此有必要建立NCC的動物實驗?zāi)Ｐ蚚4]。本文就近年來NCC動物模型的建立，以及該模型在宿主免疫反應(yīng)、血－腦屏障破壞、宿主控制囊尾蚴生長的基因位點、癲疒 間發(fā)病機制、診斷抗原以及藥物療效評估等方面的應(yīng)用研究進行綜述。

1 NCC動物模型發(fā)展概況

NCC動物模型多集中于嚙齒類的小鼠和哺乳動物的豬，兔曾被作為NCC動物模型加以研究，近年來則少有相關(guān)報道[5]。肥頭絳蟲感染的小鼠模型（以下簡稱NCC小鼠模型1）可以作為一個可控的和相對便宜的動物模型被應(yīng)用于NCC研究中。構(gòu)建該模型的理由在于：①由于豬帶絳蟲成蟲攜帶者病例數(shù)較少，且一旦發(fā)現(xiàn)即給予治療，因而難以獲得豬帶絳蟲蟲卵，盡管一些動物可能會在實驗中感染腸道豬帶絳蟲，但無一能維持感染到產(chǎn)生孕節(jié)和產(chǎn)生蟲卵的階段；②由于在豬體內(nèi)注射一定數(shù)量的蟲卵所獲得的囊尾蚴數(shù)目的不可預(yù)知性，作為動物模型的豬，感染豬帶絳蟲的可重復(fù)性極為有限；③處理活的豬帶絳蟲蟲卵對人具有極大的安全風(fēng)險[6]。Matos-Silva等[7]研究發(fā)現(xiàn)，顱內(nèi)注射肥頭絳蟲囊尾蚴可導(dǎo)致BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠顱內(nèi)炎癥反應(yīng)和壞死，前者表現(xiàn)為早期炎癥和晚期壞死，以及急性炎癥模式；后者則表現(xiàn)為早期壞死和晚期炎癥，以及慢性炎癥模式。

Cardona等[8]構(gòu)建了顱內(nèi)感染的BALB/c小鼠模型，該動物模型由顱內(nèi)注射中殖孔絳蟲而構(gòu)建（以下簡稱NCC小鼠模型2）。該研究有助于人們更好地理解發(fā)生NCC時機體釋放/分泌抗原誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)，以及CNS內(nèi)環(huán)境和發(fā)病機制[3]。

2 NCC動物模型的應(yīng)用

2.1 模型用于囊尾蚴抗原誘導(dǎo)的宿主免疫反應(yīng)研究 有研究利用NCC小鼠模型2結(jié)合基因敲除技術(shù)，構(gòu)建了囊尾蚴顱內(nèi)感染的多種基因敲除小鼠模型，如 TLR2-/-模型、STAT6-/-模型、MyD88-/-模型以及TCRδ-/-模型等。這些模型所涉及的基因分別參與宿主先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)，用于NCC患者CNS病理生理變化研究。TLR2-/-和STAT6-/-小鼠NCC病情較野生小鼠更為嚴(yán)重，與之相反，MyD88-/-小鼠和TCRδ-/-小鼠病情則較野生小鼠輕[9-12]，這提示多種先天性免疫和適應(yīng)性免疫分子可能參與NCC宿主免疫反應(yīng)。

此外，研究者還用實時熒光定量PCR及原位免疫熒光顯微鏡研究腦部感染囊尾蚴的NCC小鼠模型 2，結(jié)果除 Toll樣受體（Toll-like receptor,TLR）5在小鼠腦組織蛋白水平表達無上調(diào)外，所有其他TLRs（TLR1～4,6～9,11～13）在 mRNA 及蛋白水平均較正常未感染小鼠腦組織表達上調(diào)。在感染細胞類型方面，TLR2僅表達于神經(jīng)細胞，TLR1和TLR9主要表達于滲出的淋巴細胞，其余 TLRs（TLR3～8,TLR11～13）既表達于神經(jīng)細胞又表達于免疫細胞，這提示TLRs通過免疫細胞和神經(jīng)細胞的相互作用參與小鼠抗NCC先天性免疫[13]。

2.2 模型用于宿主血腦屏障破壞和白細胞滲出機制研究 大腦內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定通常受到血-腦屏障（blood brain barrier,BBB）和血-腦脊髓液屏障（blood-cerebrospinal fluid barrier,BCB）的保護，BBB和BCB屏障在CNS不同解剖區(qū)域中發(fā)揮功能，包括不同類型的血管中，如蛛網(wǎng)膜下腔血管、軟腦膜血管、腦實質(zhì)（大腦皮層）血管和腦室血管。通過對NCC動物模型豬的腦組織免疫組織化學(xué)研究，證實NCC豬腦組織內(nèi)出現(xiàn)星型膠質(zhì)細胞聚集、軸突降解和BBB滲透性改變[14]。

NCC小鼠模型2被用于鑒別BBB和BCB滲透率變化以及確定這種變化與白細胞浸潤的關(guān)系。將NCC小鼠模型2在感染后不同時期處死，利用三色免疫熒光抗血清蛋白檢測方法，對所感染腦組織的不同解剖區(qū)域的BBB通透性、星形膠質(zhì)細胞表達和特定的細胞表面標(biāo)志物進行評估，以揭示特定位置的CNS浸潤的白細胞亞群情況。結(jié)果表明，感染導(dǎo)致腦血管結(jié)構(gòu)及通透性改變、血清蛋白增加和白細胞外滲[15]。其他關(guān)于NCC小鼠模型2的研究表明，宿主BBB破壞表現(xiàn)為基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases,MMPs）活性增加和連接復(fù)合體蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)改變及消失；室管膜為白細胞浸潤到腦室的主要部位；軟腦膜和腦實質(zhì)的連接復(fù)合體蛋白，尤其是緊密連接蛋白和黏附連接蛋白，表現(xiàn)為結(jié)構(gòu)消失或蛋白水解[16-18]。

Mishra和Teale[19]使用激光捕獲顯微解剖顯微結(jié)合微陣列分析研究證實，NCC小鼠模型2室管膜細胞382個基因的表達發(fā)生了改變，通過實時熒光定量PCR對上述免疫應(yīng)答相關(guān)基因進行了驗證。他們用獨創(chuàng)性路徑分析（ingenuity pathway analysis,IPA）揭示了上述基因參與了先天性免疫反應(yīng)、抗原表達和白細胞浸潤，同時也參與了糖類、脂類以及小分子物質(zhì)的生物化學(xué)反應(yīng)。此外，他們用熒光顯微鏡在蛋白質(zhì)水平證實主要組織相容性復(fù)合體Ⅱ類分子和包括趨化因子配體12在內(nèi)的趨化因子上調(diào)。

Mishra和Teale[20]還使用上述研究方法研究證實，NCC小鼠模型2的BBB軟腦膜血管受影響的380個基因中，285個基因上調(diào)，95個基因下調(diào)，進而應(yīng)用IPA評估具有生物意義的差異表達基因。結(jié)果顯示，受影響最顯著的基因是與炎癥反應(yīng)、細胞間的信號傳遞和相互作用、細胞運動、免疫細胞運輸、抗細菌反應(yīng)以及胚胎發(fā)育相關(guān)的基因。該研究提示，NCC小鼠室管膜細胞和軟腦膜血管參與免疫介質(zhì)的表達，并有可能在感染過程中導(dǎo)致所觀察到的免疫病理變化。

2.3 模型用于宿主基因?qū)δ椅豺噬L影響的研究 Ramirez-Aquino等[21]使用分子遺傳學(xué)等手段研究NCC小鼠模型1中影響囊尾蚴生長的宿主基因。結(jié)果表明，A/J小鼠對肥頭絳蟲腹腔感染呈易感狀態(tài)，而C57BL/6J小鼠則相對不易感，感染30 d后二者腹腔囊尾蚴數(shù)量可差10倍；通過2種小鼠的雜交構(gòu)建了34個不同的AcB/BcA重組同類品系小鼠，通過對單核苷酸多態(tài)性的分析，發(fā)現(xiàn)影響囊尾蚴生長的宿主基因位于2號染色體和6號染色體上，而更深入的研究發(fā)現(xiàn)了在2號染色體上的肥頭絳蟲限制性位點1，而這個位點的突變導(dǎo)致補體C5的表達缺陷。上述結(jié)果提示，補體C5在肥頭絳蟲感染引起的早期保護性炎癥反應(yīng)中起到了至關(guān)重要的作用。

2.4 模型用于NCC癲疒 間發(fā)作分子基礎(chǔ)研究 NCC是豬帶絳蟲的囊尾蚴引起人體CNS感染的寄生蟲疾病，是癲疒 間 發(fā)作的主要原因之一。癲 疒間發(fā)作的機制主要是囊尾蚴誘發(fā)宿主腦實質(zhì)炎癥反應(yīng)。既往研究表明在小鼠NCC的早期肉芽腫中輔助性T細胞（T helper cells，Th）1型細胞因子連續(xù)表達，隨后Th2細胞因子在晚期肉芽腫中表達。小鼠NCC模型1顱內(nèi)肉芽腫中致炎因子表達與癲 疒間無關(guān)[22]。P物質(zhì)（substance P,SP）誘導(dǎo)Th1細胞因子的表達和肉芽腫形成，而生長抑素抑制肉芽腫反應(yīng)。有研究表明，神經(jīng)肽可能調(diào)節(jié)囊尾蚴病中的肉芽腫反應(yīng)[21]。為了檢驗這一假設(shè)，他們采用原位雜交和免疫組織化學(xué)方法比較了SP和生長抑素在小鼠NCC模型1的囊尾蚴肉芽腫中的表達情況及與肉芽腫的關(guān)系。SPmRNA主要表達在肉芽腫形成的早期階段，而生長抑素mRNA則主要表達在肉芽腫形成的后期階段。SPmRNA表達在肉芽腫形成早期水平顯著高于肉芽腫形成中晚期（P=0.008），生長抑素mRNA在后期肉芽腫階段的表達水平明顯高于早期水平（P=0.008）。SP和生長抑素在時間表達上的差異，可能與小鼠NCC肉芽腫Th1和Th2細胞因子的差異表達相關(guān)[23]。

另一研究也通過NCC小鼠模型1誘導(dǎo)癲 疒間發(fā)作的研究發(fā)現(xiàn)，海馬回注射SP或野生型小鼠囊尾蚴肉芽腫提取物可誘發(fā)小鼠癲 疒間發(fā) 作，而來自SP前體缺陷小鼠或SP受體缺陷小鼠的囊尾蚴肉芽腫提取物則不能誘發(fā)癲疒 間發(fā)作。癲 疒間發(fā)作水平與SP水平正相關(guān)，且可被SP受體拮抗劑拮抗。提示SP是誘導(dǎo)人類癲疒 間 的主要物質(zhì)，且該癲 疒間可能被SP受體拮抗劑預(yù)防或治療[24]。

2.5 模型用于診斷抗原、藥物療效評估和疫苗研究 由于肥頭絳蟲和豬帶絳蟲抗原具有高度交叉免疫反應(yīng)，由肥頭絳蟲所構(gòu)建的NCC動物模型可能為人類 NCC 診斷提供基礎(chǔ)[25-27]。Espíndola 等[26]利用NCC動物模型構(gòu)建了肥頭絳蟲和豬帶絳蟲囊尾蚴單克隆抗體，發(fā)現(xiàn)豬帶絳蟲18 kDa蛋白與肥頭絳蟲18 kDa和14 kDa蛋白具有交叉反應(yīng)性。免疫親和純化的18 kDa和14 kDa蛋白被用于ELISA方法診斷NCC，該方法靈敏度達到100%，相對于其他炎癥性和非炎癥性患者腦脊液，特異度達到99.1%～100%。Peralta等[27]利用NCC動物模型證實由肥頭絳蟲囊液中純化的14 kDa蛋白與豬帶絳蟲抗原具有同源性，有望用于NCC免疫診斷。

為評估地塞米松對NCC誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)是否具有保護作用，García de Llano等[28]將囊尾蚴注射入25只兔小腦延髓池，同時使用地塞米松治療，2周后處死兔，研究其腦部病理變化。發(fā)現(xiàn)地塞米松確實對NCC炎癥反應(yīng)具有保護作用。用NCC小鼠模型1研究還證實，多西環(huán)素可以通過降低細胞凋亡水平和MMPs活性，從而降低小鼠NCC患病率及病死率[29]。

此外，NCC小鼠模型1和口服豬帶絳蟲囊尾蚴感染的倉鼠還被用于疫苗研究[30-31]。Baig等[30]使用豬帶絳蟲半胱甘酸蛋白酶免疫BALB/c小鼠，并以肥頭絳蟲感染該小鼠，發(fā)現(xiàn)免疫后小鼠較未免疫小鼠帶蟲率下降了72%。León-Cabrera等[31]使用重組的豬帶絳蟲鈣網(wǎng)蛋白免疫倉鼠，發(fā)現(xiàn)其對9月齡倉鼠保護率可達到40%～100%。

3 小 結(jié)

由豬帶絳蟲囊尾蚴感染人腦導(dǎo)致的NCC，因其所導(dǎo)致強烈炎癥反應(yīng)、腦水腫、顱內(nèi)高壓及癲疒 間，對人類健康危害極大，但在體內(nèi)難于開展病理生理機制研究。NCC動物模型多由其他絳蟲感染所構(gòu)建，一定程度上彌補了豬帶絳蟲囊尾蚴感染動物模型難于構(gòu)建的不足。

NCC動物模型研究意義在于，無論是有癥狀的NCC還是無癥狀NCC，在囊尾蚴感染期間都會誘發(fā)先天性免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的復(fù)雜調(diào)節(jié)狀態(tài)，伴或不伴有炎癥反應(yīng)。無癥狀NCC的免疫入侵機制至今未明，NCC小鼠模型為理解NCC不同階段的潛在機制提供了重要模型。NCC小鼠動物模型揭示，中殖孔絳蟲感染在顱內(nèi)首先誘發(fā)Th1免疫反應(yīng)，巨噬細胞、中性粒細胞和γδT浸潤并表達致炎因子，隨后αβT浸潤。同樣應(yīng)用該模型，成功鑒定了BBB破壞動力學(xué)和解剖定位。而且，NCC小鼠模型還研究了包括TLR及其下游信號通路在內(nèi)的先天免疫細胞受體活性變化，揭示了關(guān)于炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)機制。NCC小鼠動物模型還在一定程度上揭示了宿主控制囊尾蚴生長的基因位點和癲 疒間發(fā)作的分子基礎(chǔ)，為診斷抗原、藥物療效評估和疫苗研究提供了良好、可用和可重復(fù)性的動物模型。

由NCC實驗動物所得研究結(jié)果，對理解NCC宿主-寄生蟲關(guān)系極為重要，如NCC動物模型在宿主免疫、宿主BBB破壞、宿主控制囊尾蚴生長的基因位點、癲疒 間發(fā)病機制、診斷抗原和藥物療效評估等方面的研究，一定程度上揭示了NCC病理生理機制，為NCC診斷、治療及疫苗研究提供了理論依據(jù)。

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