響應面優化野生櫻桃李葉總黃酮的超聲輔助提取工藝

劉 偉，何曉燕，陳文強，朱 燕，代思月，歐陽艷

新疆維吾爾自治區普通高校天然產物化學與應用重點實驗室 伊犁師范學院，伊寧 835000

野生櫻桃李(Prunus divaricataLdb.)，俗稱野酸梅，薔薇科李屬，落枝灌木或小喬木。植株高1.5～8.0 m，多分枝，枝條細長，開展形，葉繁茂，深綠色［1］，主要分布于中亞天山、高加索、小亞細亞及巴爾干半島，在我國僅分布于新疆伊犁霍城縣的大西溝和小西溝［2］。本地哈薩克牧民長期食用櫻桃李果醬或將果實曬干泡茶飲用，高血脂及高血壓患者較少，因此野生櫻桃李被譽為“雪域珍果”［3］，具有天然的保健功能和開發前景。國內學者對野生櫻桃李的研究多集中在生態、栽培及果實營養成分等方面，對其有效成分的提取與活性研究近年來才逐步開展，其中野生櫻桃李果皮色素和果肉總酚提取物均表現出了較好的抗氧化活性［4，5］。黃酮類化合物是植物花、葉等器官中的重要次級代謝產物，在心血管病治療、抗病毒、抗腫瘤、保肝、抑菌、抗衰老等方面有著廣泛的用途［6］。超聲波輔助提取是利用超聲波的空化效應、熱效應和機械作用來加快物質的溶出，縮短提取時間，提高提取效率［7］。近年來，超聲輔助提取技術廣泛應用于提取天然產物有效成分黃酮、生物堿、三萜等研究領域中［8，9］。本文采用超聲輔助提取的方法，在單因素試驗基礎上，結合響應面法優化野生櫻桃李葉總黃酮的超聲輔助提取工藝，以期為野生櫻桃李資源的利用與開發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料與試劑:野生櫻桃李樹葉于新疆伊犁霍城縣大西溝10月份采摘，經伊犁師范學院資源與生態研究所趙玉副教授鑒定為薔薇科野生櫻桃李葉，洗凈自然晾干后50 ℃烘干至恒重，粉碎過60 目篩備用，樹葉標本存放于伊犁師范學院資源與生態研究所。蘆丁標準品，國藥集團化學試劑有限公司(批號:65011360);亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、氯化鋁、無水乙醇均為分析純。

儀器:UV-2550 紫外可見分光光度計(日本島津分析儀器廠);XH-2008D 智能溫控低溫超聲波催化合成儀(北京祥鵠科技發展有限公司);DD-5M 型低速離心機(湘儀離心機有限公司);FA2104 電子天平(上海舜宇恒平科學儀器有限公司);BAO-150AG型電熱恒溫干燥箱(上海亞榮生化儀器廠)。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制

為避免含鄰二酚類化合物對總黃酮含量測定的干擾，參照文獻［10］，選用對黃酮類化合物專屬性較強的AlCl3法測定樣品總黃酮含量。精確稱取蘆丁標準品25.0 mg，用少量的60%乙醇溶液溶解后定容于100 mL 容量瓶中，搖勻得0.25 mg/mL 的蘆丁標準溶液，備用。精密移取上述蘆丁標準溶液0.0、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL，分別加入盛有5.0 mL 60%乙醇溶液的25 mL 相同規格的容量瓶中，再加0.1 mol/L AlCl3溶液2.0 mL，用60%乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min，以加入0.0 mL 蘆丁的溶液為空白對照，于417 nm 處測定吸光值。以蘆丁標準溶液質量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線得y=27.93619x+0.0023，R2=0.9999，結果表明在濃度8.0 μg/mL 至18.0 μg/mL范圍內兩變量呈現良好的線性關系。

1.2.2 野生櫻桃李葉總黃酮提取單因素試驗

精密稱取1.0000 g 的備用野生櫻桃李葉，固定料液比1 ∶30 g/mL、提取溫度70 ℃、提取時間30 min，考察不同乙醇體積分數(30%、40%、50%、60%、70%)對總黃酮提取的影響;其它條件不變，設定試驗所得最適乙醇體積分數，考察不同提取溫度(40、50、60、70、80 ℃)對總黃酮提取的影響;按照上述方法依次考察超聲提取時間(10、20、30、40、50 min)、料液比(1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL)對總黃酮提取的影響;上述試驗均在300 W 功率下超聲提取2 次，合并提取液，將提取液4000 rpm 離心10 min，取上清液定容待測。精密移取1.0 mL 定容后的溶液按照1.2.1 方法測定總黃酮含量，重復3 次取平均值。

式中:Y為總黃酮含量(mg/g)，k待測液與測試液體積之比，c為標準曲線法計算所得濃度(mg/mL)，V為測試液定容的體積(mL)，m為野生櫻桃李葉質量(g)。

1.2.3 響應面設計

在單因素試驗的基礎上，以總黃酮提取量為響應值，選取乙醇體積分數(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為自變量，采用Box-Benhnken 設計三因素三水平試驗，因素水平設計見表1，利用Design-Expert.8.05 軟件對實驗數據進行分析。

表1 響應面試驗因素及水平表Table 1 Factors and levels of RSM test

1.2.4 超聲輔助提取法與傳統索氏提取法效果比較

準確稱取1.0000 g 的備用野生櫻桃李葉，分別采用超聲輔助提取法(在響應面優化的最佳工藝參數進行)，傳統索氏提取法(與超聲提取相同的提取溶劑和料液比，微沸狀態提取4 h)，考察不同提取方法對野生櫻桃李葉總黃酮提取的影響。

2 結果與分析

2.1 不同提取條件下單因素試驗結果

圖1 乙醇體積分數(a)、提取溫度(b)、超聲時間(c)及料液比(d)對總黃酮提取量的影響Fig.1 Effect of ethanol concentration (a)，extraction temperature (b)，ultrasonic time (c)and solid-liquid ratio (d)on extraction yield of total flavonoids

由圖1a 可知，當乙醇體積分數小于50%時，野生櫻桃李葉總黃酮提取量隨著乙醇體積分數的增大而增高。黃酮類化合物在植物體中通常與糖結合成苷類，小部分以游離態(苷元)的形式存在。推測原因為野生櫻桃李葉中黃酮苷類物質較多，黃酮苷水溶性較好，當以極性較大的溶劑提取時效果較好。試驗過程中發現當乙醇體積分數大于60%時，所得提取溶液顏色明顯加深，在417 nm 的紫外吸收值會突然增大。有文獻報道乙醇濃度是影響色素提取的顯著因素［11］。當提取溶劑濃度大于60%時野生櫻桃李葉中的色素、糖類等物質會溶于溶劑中，影響了黃酮類化合物的浸出，干擾因素也隨之增大。因此，選擇50%乙醇為最適宜提取溶劑。由圖1b 可知，當提取溫度在40～70 ℃之間，提取溫度與總黃酮提取量呈正相關性，可能是溫度升高加劇了黃酮分子之間碰撞頻率，植物細胞更容易破裂，加快了黃酮類化合物的溶出。當提取溫度超過70 ℃后，總黃酮提取量有所降低，可能是溫度過高對野生櫻桃李葉中總黃酮的組織結構有所破壞，與李楠等［12］報道一致;此外，在80 ℃時溶劑易揮發也會影響總黃酮的提取效果。因此選擇提取溫度為70 ℃為宜。由圖1c 可知，當超聲時間在30 min 之前，總黃酮提取量隨時間的延長增加顯著，之后略有下降。可能是由于超聲波的強振動、強空化效應等對植物細胞壁的破壞作用，加快了細胞內容物的溶出［13］。隨著超聲時間的延長，植物細胞膜會進一步被破壞，其中的粘液等雜質溶出使提取液粘度增大，影響提取效果。因此選擇30 min 為適宜提取時間。由圖1d 可知，總黃酮的提取量隨著料液比的增加呈現先快速增長而后下降的趨勢。增加提取溶劑用量，可以使物料與溶劑充分接觸，同時可以增加傳質動力，從而有助于總黃酮的溶出。當料液比達到1∶40 g/mL 后，總黃酮提取量有所下降，可能是溶劑過多，在超聲作用下野生櫻桃李葉中其它成分溶出，影響了總黃酮的提取。考慮到溶劑成本，選擇1∶40 g/mL 為適宜料液比。

2.2 響應面分析優化總黃酮提取工藝

在單因素驗驗基礎上，固定提取時間，以乙醇體積分數(A)、提取溫度(B)、料液比(C)為自變量，以總黃酮提取量為響應值，設計17 次試驗，其中析因部分試驗12 次，中心點重復試驗5 次，結果見表2。

實驗以隨機次序進行，利用Design-Expert 8.05軟件對數據進行多元回歸擬合，得到以總黃酮含量Y為目標函數:Y=38.18 +0.38A+0.65B+1.15C+0.47AB+0.095AC+0.15BC-2.17A2-0.91B2-0.63C2。

對上述模型進行方差分析，結果見表3。由表3可知，總模型F值為31.31，表明模型顯著;模型P＜0.0001，響應面回歸模型達到極顯著水平。線性項、二次項及交互項AB 的P值＜0.05，表明其對總黃酮提取量影響顯著;其它交互項AC 與BC 顯著性較差，表明總黃酮提取量與自變量非簡單的線性關系;模型失擬項表示模型預測值與實際值不擬合的概率［14］，模型中失擬項P值為0.1122 ＞0.05，表明數據擬合效果較好，模型選擇合適。模型變異系數CV 值為1.07，說明模型穩定性好;模擬方程的相關系數說明實驗誤差較小，可以利用該模型預測上述提取條件對總黃酮提取量的影響。三個試驗因素對響應值的影響順序為C ＞B ＞A。

表2 Box-Behnken 試驗設計及結果Table 2 Box-Behnken experimental design and result

表3 回歸方程的方差分析Table 3 Analysis of variance for the fitted regression model

注:差異極顯著，＊＊P ＜0.01，差異顯著，* P ＜0.05。Note:very significance different，＊＊P ＜0.01，significance different，* P ＜0.05.

響應面圖形能較直觀地反映出各因素對響應值的影響，等高線的形狀可以反映出交互效應的強弱，橢圓形表示兩因素交互作用顯著，而圓形則與之相反［14］。圖2 分別顯示了3 組試驗參數以總黃酮提取量為響應值的趨勢圖。其中料液比(C)對總黃酮提取量的影響最為顯著，乙醇體積分數(A)與提取溫度(B)的交互作用最為顯著，表現的等高線最扁平;乙醇體積分數(A)和料液比(C)的交互作用最小，與模型方差分析結果一致。在實驗考察范圍內，總黃酮提取量隨乙醇體積分數、提取溫度、料液比自變量的增大均呈現出先增大后減小的趨勢，表明三個自變量過高或過低都不利于總黃酮的提取。

由Design-Expert 8.05 軟件分析得到總黃酮最佳提取條件為乙醇體積分數50.80%、提取溫度72.38 ℃、料液比1∶44.91 g/mL，理論總黃酮提取量為38.93 mg/g。為方便操作，總黃酮最佳提取優化工藝參數調整為乙醇體積分數51%、提取溫度72℃、料液比1∶45 g/mL。

圖2 不同自變量交互作用對總黃酮提取量影響的響應面Fig.2 Response surface plots showing the interaction of different independent variables on yield of total flavonoids

2.3 超聲輔助提取法與傳統提取法效果比較

以51%的乙醇為提取溶劑，固定料液比為1∶45 g/mL，采用超聲輔助法在72 ℃下提取30 min，提取2 次，合并提取液，離心，定容，測定總黃酮含量。重復3 次，所得總黃酮含量平均值為38.27 mg/g，與理論值基本一致。這表明響應面法優化超聲輔助提取野生櫻桃李葉中總黃酮的提取工藝準確可靠，具有一定的實用價值。相比傳統索氏提取法(總黃酮提取量平均值為35.59 mg/g)大大縮短了提取時間，提高了效率。索氏提取在高溫下隨著提取時間延長，樹葉中非黃酮類物質也會逐漸溶出，對后續的總黃酮含量檢測帶來不便。

3 討論

超聲輔助提取結合響應面法在優化植物有效成分的提取工藝中已得到廣泛應用［15］。傳統的索氏提取法耗時長，有效成分長時間在高溫提取環境中易被破壞。試驗表明，超聲輔助提取野生櫻桃李葉中總黃酮較傳統的索氏提取法效率高，后續操作簡單，提取效果好。野生櫻桃李葉總黃酮的提取工藝研究還未見報道，本文在單因素試驗基礎上進行三因素三水平Box-Behnken 試驗設計，利用響應面分析法優化野生櫻桃李葉總黃酮提取條件。結合實際可操作性得出較優工藝條件為乙醇體積分數51%、提取溫度72 ℃、料液比1∶45 g/mL，在300 W 功率下超聲提取30 min，提取次數2 次，優化后的試驗結果與理論預測值基本一致。該方法耗時短，操作方便，提取效率高，為野生櫻桃李葉黃酮類化合物的開發利用提供了理論依據。

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