代謝組學技術及其在茶葉研究中的應用

周瓊瓊，孫威江，2*

1 福建農林大學園藝學院;2福建農林大學安溪茶學院，福州 350002

隨著人類基因組測序工作的完成，生命科學研究跨入了后基因組時代，基因功能的研究逐漸成為熱點，隨之出現了一系列的“組學”研究，包括研究轉錄過程的轉錄組學(transcriptomics)、研究某個生物體系中所有蛋白質及其功能的蛋白質組學(proteomics)及研究代謝產物的變化及代謝途徑的代謝組學(metabolomics 或metabonomics)。

1 代謝組學概述

代謝組學是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后興起的系統生物學的一個新的分支，是通過考察生物體系受外界刺激或擾動后其代謝產物的變化來研究生物體系代謝途徑的一門科學［1，2］。它所關注的是相對分子質量為1000 以下的小分子物質，其任務在于檢測和量化生物體內各種代謝物組分與含量及其變化規律，揭示生命現象和過程［3］。它是以組群指標分析為基礎，以高通量檢測和數據處理為手段，以信息建模與系統整合為目標，從而對生物體的代謝產物進行定性定量分析。代謝組學的概念自上世紀90年代提出后便迅速發展，并滲透到科學研究的各個領域，在臨床研究、藥物研發與毒理安全性評價、天然藥物質量控制、食品營養與食品品質鑒別、微生物和植物代謝、功能基因組學等方面蓬勃發展，取得了巨大的進展［4-8］。

代謝組學的研究可追溯到上世紀70年代基于代謝譜的分析(metabolic profiling)，由Hornings 引入這一概念［9，10］，最初代謝輪廓分析的定義為描述與生物體代謝分析相關的代謝物的代謝模式的多組分分析的方法［10］。研究者主要是采用氣相色譜-質譜聯用技術(GC-MS)對人體代謝產物如類固醇、有機酸及其生物體液中藥物的代謝物進行定性、定量分析及對疾病進行分析和診斷，這種在臨床上利用代謝譜分析診斷有關疾病的方法一直沿用至今，開創了對復雜樣品進行代謝輪廓分析的先河。80年代，人們開始應用高效液相色譜(HPLC)和核磁共振(NMR)的技術來進行代謝輪廓的分析［2］。90年代后，代謝輪廓分析技術一直平穩發展，研究內容主要集中于藥物在體內的代謝、轉化等方面，其間Sauter等率先將代謝組分析引入植物系統診斷［11］，這種基于代謝組分析來研究外界因素對生物功能影響的研究思路隨即被人們認可。Nicholson［1］研究小組于1999年首先提出代謝組學(metabonomics)的概念，其主要以核磁共振技術研究人或動物在疾病作用下代謝產物的變化情況，應用于疾病的早期診斷和治療等相關領域，使代謝組學得到了極大的充實。2000年，Fiehn［12］等提出了另一種代謝組學(metabolomics)的概念，全面、定量分析生物體系中所有代謝物，并將其應用于植物學的研究，將生物體的代謝產物和生物基因的功能聯系起來，指出每種基因型都具有一種獨特的代謝輪廓，代謝組學作為一種分析工具擴展和增強了已存在的功能基因組學的研究力量。至此形成了當前代謝組學的兩大主流領域metabonomics 和metabolomics。Metabonomics是評價生物體對病理生理刺激或基因修飾產生的代謝物質的質和量的動態變化的研究，一般以細胞或者動物的體液或組織為研究對象［13］，主要用于藥物研究和疾病診斷等領域;Metabolomics 是代謝控制論提升的學科，主要用于植物和微生物領域。現在這兩個定義已經模糊化，沒有特別的區分［14］。

2 代謝組學的研究技術

代謝組學研究一般包括樣品采集和制備、代謝組數據的采集和預處理、多變量數據分析、目標物識別和途徑分析等步驟。

2.1 分析技術平臺

樣品的采集和制備是代謝組學研究的初始步驟，也是最重要的步驟之一。代謝產物通常用水或有機溶劑(如甲醇、石油醚等)提取，經過萃取、層析、親和色譜等方法以獲得水相提取物和有機相提取物，然后運用色譜、色譜-質譜聯用或核磁共振等技術檢測提取物中代謝物的種類和含量，獲得大量多維復雜數據，之后采用化學計量學方法進行數據分析，識別出有顯著變化的代謝標志物，從而研究代謝途徑和變化規律，闡明生物體的反應機制。由于代謝產物和生物體系的復雜性，至今為止，沒有一種能夠適合所有代謝產物的分析技術，大多采用聯用技術和多個方法的綜合分析。色譜-質譜聯用技術、毛細管電泳-質譜聯用技術、核磁共振(NMR)、紅外光譜等分離分析手段及其組合都出現在代謝組學的研究中，其中全球應用最多的代謝組學分析手段為核磁共振(尤其是1H-NMR)和質譜技術［15］。

質譜技術具有較高的靈敏度和廣泛的適用性，基于質譜技術的代謝組學研究在藥物開發、臨床疾病、食品安全、植物學、微生物學、環境監測等領域發揮著重要作用［16］。目前應用最廣泛最有效的研究技術是氣相色譜-質譜(GC-MS)和液相色譜-質譜(LC-MS)。

就GC-MS 分析技術而言，可將代謝物分為兩類:不需要化學衍生的揮發性代謝物和需要化學衍生的非揮發性代謝物。揮發性代謝物一般是熱穩定、易揮發的化合物，非揮發性代謝物如氨基酸、脂肪酸等一般是極性強、揮發性低、熱穩定性差的化合物需要進行適當的衍生轉化為揮發性的物質才能進行分析。GC-MS 的優勢在于能夠提供較高的分辨率和檢測靈敏度，并且有可供參考、比較的標準譜圖庫，可以方便地得到待分析代謝物的定性結果。

高效液相色譜更適合于高沸點、大分子和熱穩定性差的化合物的分離分析，由于已知的化合物大約有70%是不揮發的，因此液相色譜有著廣闊的應用空間，與串聯質譜的聯用更是實現了對復雜基質中結構相似的化合物的分析，大大提高了分辨率和精確測定的能力。隨后發展的超高效液相色譜與質譜聯用擴展了分析物的覆蓋率，可以獲得靈敏度比HPLC-MS 大有改善的分離結果，獲得更多、質量更好的信息。多維氣質和液質聯用的發展，對復雜體系中的目標物分析有著突出的優勢。因此這兩種技術可以檢測包括糖類、氨基酸、有機酸、脂肪酸和芳胺，以及大量次級代謝物在內的數百種化學性質不同的化合物［17］，這是其它任何一項技術無法比擬的。

核磁共振技術(NMR)是一種基于具有自旋性質的原子核在核外磁場作用下，吸收射頻輻射而產生能級躍遷的譜學技術。生命科學領域中常用的是氫譜(1H NMR)、碳譜(13C NMR)及磷譜(31P NMR)3 種，可用于體液或組織提取液和活體分析兩大類，其中以1H NMR 應用最為廣泛［18］。NMR 技術能夠實現對樣品的非破壞性、非選擇性分析，不破壞樣品的結構和性質，無輻射損傷;可在一定的溫度和緩沖液范圍內選擇實驗條件，可以進行實時和動態的監測;樣品處理簡單，分析速度快［19］。NMR 技術的不足在于靈敏度低、分辨率不高，動態范圍有限，很難同時測定生物體系中共存的豐度相差較大的代謝物。但隨著近年新發展的魔角旋轉技術、多維核磁共振技術以及LC-NMR 聯用，使基于NMR 技術的代謝組學研究日趨完善。

2.2 數據分析平臺

代謝組學技術對樣品進行分析后得到的是大量的、多維的分析數據，需要借助于化學計量學方法進行數據的分析與解釋。目前數據分析常用的兩類算法是基于尋找模式的非監督方法和有監督方法。

聚類分析(CA)是一種非常實用的多元統計方法，是將類似的樣本聚在一起，從而獲得分類，不需要事先確定樣本的類型歸屬，沒有可供學習利用的訓練樣本，因此稱為非監督學習方法。主要包括主成分分析(PCA)、非線性映射(NLM)和分級聚類法(HCA)等。

有監督的模式識別方法是利用一組已知分類的樣本作為訓練集，利用計算機獲取分類的基本模型，進而利用這一模型對未知樣本進行類型判斷。常用的方法有K 最鄰近法(K-NN)、偏最小二乘法-判別分析(PLS-DA)、軟獨立建模分類法(SIMCA)和人工神經元網絡(ANN)分析等數據分析方法。近年來，由于支持向量機(SVM)對于數據高維的特點不敏感，因此特別適合于處理樣本數量較少而維數很高的生物數據，因此在代謝組學后期數據的判別分析中也應用較多。

3 代謝組學在茶葉研究中的應用

植物代謝組學是代謝組學的一個重要分支。植物代謝組學是對植物的某一組織或細胞在特定生理時期內所有低分子量代謝產物同時進行定性和定量分析［20］。得益于高通量檢測技術的日益成熟和成本的降低，植物代謝組學的應用也從描述單一代謝途徑走向與其它組學技術相結合，通過基因組、轉錄組、蛋白組和代謝組對傳統遺傳學和生物表型進行直接聯系，并將現有的數據庫相關聯，圍繞特定的生物學問題，共同揭示植物生命活動的奧秘。

伴隨著茶葉貿易全球化，各區域茶葉消費呈現多元化態勢，消費者對茶葉的質量與安全追求日益提高，如何利用新的科學研究方法(如代謝組學、基因組學等)，不斷的提高茶葉工藝水平，提高茶葉質量，是現如今茶學科研工作者的重要課題。

3.1 茶樹生長發育的研究

不同的栽培管理，不同的生長發育階段影響茶樹本身理化成分的代謝方式，進而改變茶葉的品質。Ku KM［21］等利用代謝組學方法研究了遮蔭處理下茶樹次級代謝產物的變化以及抗氧化活性的能力。Lee［22，23］等利用1H-NMR 和多元分析研究同一品種不同采摘位置茶葉和莖的化學成分，發現隨著茶樹葉片生長發育，茶氨酸、咖啡堿和沒食子酸水平上升，而兒茶素類、葡萄糖和蔗糖水平下降;茶莖則具有很高的茶氨酸水平和很低的兒茶素類水平，揭示了葉片和莖存在不同的代謝模式，合理利用茶葉和茶莖，可使產品的主要化學成分更加協調合理;同樣，利用代謝組學方法探討了不同氣候條件下茶葉代謝產物的變化。郝亞利［24］基于代謝譜手段分析了不同光質處理對茶鮮葉品質形成的影響，監測不同生育期茶鮮葉樣品中的氨基酸、兒茶素、生物堿和黃酮組分及其含量的動態變化。楊亦揚［25］等采用基于1H-NMR 的代謝組學非靶標分析與高效液相色譜法進行的定量靶標分析兩種方法，比較白天和夜晚所取不同施氮水平的茶樹新梢第2 葉的代謝產物差異，探討代謝組學研究方法應用于茶葉品質成分形成機理研究的可行性。由此說明，生長環境、栽培管理方式對植物的生長代謝是有很大影響的。

3.2 茶樹品種及產地溯源

茶葉種類繁多，種質資源豐富，同一產地不同品種或同一品種不同茶地加工的茶葉品質往往會有較大的差異，利用代謝組學分析手段對原料品種、產地等的溯源有利于維護市場秩序，防止以假亂真，促進與茶葉相關的農業文化遺產保護，從而為茶葉的地理標志性保護提供依據。

李萬春［20］等采用衍生化GC-MS 方法，對福建省安溪縣境內8 個鄉鎮的鐵觀音及其它三個烏龍茶品種(黃金桂、本山和毛蟹)進行代謝組學分析研究，通過化學計量學對數據進行處理、建模，確定茶葉的品種及產地，PCA 結果表明安溪縣境內不同鄉鎮的鐵觀音表型有明顯的差異，相鄰鄉鎮的茶葉代謝表型相似，為辨別安溪鐵觀音真偽奠定了基礎。王麗鴛［26，27］等利用多元化學指紋圖譜方法對杭州、麗水和新昌三個地區以龍井43、群體種和迎霜品種加工制作的9 類扁形綠茶產品進行判別分析，結果表明同一品種不同產地或同一產地不同品種綠茶樣本指紋圖譜間存在顯著差異;同樣，對不同品種、不同產地的武夷巖茶進行了判別分析。成浩［28，29］等研究表明采用化學指紋圖譜方法結合判別技術對茶產品的產地屬性進行鑒別或驗證分析是可行的。周健［30，31］等采用了近紅外光譜并結合PCA 和Fisher識別分類法，鑒定成品茶原料品種;之后，同樣以近紅外光譜分析技術為基礎，結合偏最小二乘模型組合分析實現對茶葉原料品種的鑒定與溯源。袁玉偉［32］等利用穩定同位素和礦物多元素檢測結合PCA-LDA 法能進行茶葉產地溯源，對福建、山東、浙江等產地的茶葉進行判別，效果較好。Fernández-Cáceres［33］等結合線性判別分析(LDA)、ANN 等化學計量法初步研究了不同產地的綠茶、黑茶、速溶茶中Al、Ca、Ba 等12 種元素的含量差異與產地間的關系。Moreda-Pi?eiro［34］等利用電感耦合等離子體原子發射光譜(ICP-AES)和電感耦合等離子體質譜(ICP-MS)測定來自不同國家茶葉中的微量金屬元素與產地土壤中微量元素，結合PCA，CA，LDA 和SIMCA 方法分析元素含量與原產地的相關性，進而判別茶葉產地。Fraser［35］等利用UPLC-MS 結合多元統計分析方法對茶葉的產地、類型進行判別。

3.3 茶葉加工過程在線檢測

茶葉原料是茶葉品質的基礎，而加工是關鍵。如今，絕大部分茶葉的加工過程主要依賴于經驗豐富的做茶師傅，“看青做青”，沒有形成標準化，可復制的加工模式。對此，日本學者Daiki［36］于2011年采用傅立葉變換近紅外光譜(FT-NIR)光譜和偏最小二乘(PLS)回歸分析，以客觀的優化日本蒸青綠茶的加工工藝。趙峰［37］等于2014年嘗試采用近紅外光譜技術實現對武夷巖茶精制過程的在線檢測，分別對武夷巖茶主要品質成分即水分、咖啡因、茶多酚和粗纖維的含量分別建立近紅外定量分析模型并檢驗，滿足生產線上對武夷巖茶品質組分快速測定的要求。

3.4 茶類判別分析

不同茶類的快速準確甄別是當前茶葉領域亟待解決的重要課題，也是茶葉國際標準的重要組成部分。

李萬春［20］等用衍生化GC-MS 方法還對綠茶、白茶、烏龍茶(鐵觀音和水仙)和紅茶進行代謝組學研究，用主成分分析對數據進行處理，PCA 結果表明不同發酵程度的四種茶葉代謝表型差異顯著。蔡健榮［38］等采用近紅外光譜結合K 最近鄰法(KNN)模式識別方法對茶葉進行識別與分類，正判率高。陳全勝［39］等收集來自全國的紅茶、綠茶、烏龍茶等共150 個樣品，采集近紅外光譜結合SVM 計量方法對三類茶葉分別建模，正判率較高，達到快速判別分析茶類，說明代謝組學方法在茶類判別分析中同樣具有應用潛力。

3.5 茶葉等級及質量評價

我國六大茶類品種眾多，品質各異，目前茶葉市場上的等級劃分存在很大的隨意性，等級的判別依然根據國標GB/T 23776 以感官審評為主，主要依靠人的嗅覺、味覺、視覺和觸覺等進行茶類等級的快速區分，然而這種評價方法較難實現標準化，審評結果只能相對而論。因此，代謝組學的興起為茶葉高效率、高精度的等級判別、質量評價提供了一種科學手段。

在茶葉的等級判別方面，日本學者應用代謝組學技術所做的研究較多。日本學者［40］基于1H-NMR技術和多元分析(PCA、PLS)的代謝組學手段對日本綠茶進行質量評價，可分離等級較好和較差的綠茶，鑒定出滋味標記化合物。Tatsuhiko［41］等通過使用傅里葉變換近紅外光譜(FT-NIR)和代謝組學技術在線預測綠茶的質量，指出5500—5200 cm-1的波長范圍與茶葉品質有很高的相關性。同樣，Pongsuwan［42-44］等分別研究了利用不同的代謝組學手段評估茶葉質量:采用GC-MS 和多變量數據分析結合評估綠茶的品質;采用熱裂解氣相色譜/質譜法(PRGC/MS)來評估日本綠茶的質量，這種技術不需要制備樣品或者衍生，快速、簡單、成本低;利用UPLC/TOF-MS 結合化學計量學方法分析綠茶中的代謝物和其質量的關聯性，指出除了沒食子兒茶素，其它主要的兒茶素(包括表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯)是日本煎茶高等級的顯著標志物。中國學者Lin［45］等采用頂空固相微萃取(HS-SPME)和GC-MS技術分析龍井茶的香氣成分，建立模型，從而最終預測綠茶質量。然而，茶葉的香氣成分在感官審評中占的比例為25%～35%，能否通過香氣質量來評估茶葉質量，還有待評估，不過這為茶葉等級的判別提供了一種新的研究思路。周小芬［46］等應用近紅外光譜分析技術對大佛龍井茶進行品質評價。

3.6 茶葉年份、季節的預測

Xu［47］等利用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)結合化學計量學多元方法，建立了區分的沱茶類型(未發酵的，發酵)和預測沱茶年份的模型。Xu［48］等利用代謝組學結合監督模式識別方法預測茶葉生產的季節，即鑒定該茶葉是春茶或夏茶。

4 代謝組學技術在茶葉研究中的應用前景

茶學是一門綜合科學涉及到多個學科、多種研究方法，包括生物學、生態學、植物學、遺傳學、化學、食品營養學和經濟學等。茶葉實現從田間到茶杯，涉及到諸多復雜的代謝產物的變化，影響茶葉最終質量和品質的因素眾多，如何把茶葉從品種選育、栽培、加工到最終產品作為一個整體，對其進行研究，是茶學發展的一個重要課題。代謝組學將茶葉原料質量與安全的控制、栽培管理、工藝優化、品質評價等指標整合，進行代謝產物研究，是一種行之有效的研究方法并在茶葉的研究方面可發揮巨大的作用。

代謝組學概念自提出到應用至今已有將近20年的時間，發展之迅速，應用之廣泛。由于代謝組處于系統生物學信息流的底端，是基因表達的最終產物，通過對生物代謝物的分析，能全面了解生物體在當前生理階段或外界刺激下的真實反應，從而更直觀的揭示生物體的遺傳背景和環境條件對生物體的決定作用。在茶學科研領域，關聯茶葉品質的生物標志物的獲取僅僅是代謝組學研究的初級目標，如何將代謝組學的數據庫與其他組學(基因組學、轉錄組學和蛋白質組學)的數據進行整合及構建代謝網絡和代謝通路的動態變化規律是研究的最終目的。目前茶葉在代謝組學與其他組學結合的研究方面還相對薄弱，今后應充分利用代謝組學為我們提供的大量植物生化表型的特征信息，通過代謝組學技術促進植物基因功能組學的研究工作，結合生物技術手段，生物信息學分析，加快茶葉品質改良的進程。因此將多種研究方法和技術手段結合起來，尤其將功能基因組學與代謝組學技術結合，將是研究植物次生代謝網絡的一條新途徑。

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