矮垂頭菊乙醇提取物的體外自由基清除活性及其對高原缺氧小鼠的保護作用研究

景臨林，馬慧萍，樊鵬程，何 蕾，賈正平

蘭州軍區蘭州總醫院藥劑科 全軍高原環境損傷防治重點實驗室，蘭州 730050

矮垂頭菊(Cremanthodium humileMaxim)是菊科垂頭菊屬的多年生草本植物，生長于海拔2400～5600 m 的高山草甸和碎石區，主要分布于西藏、青海、甘肅和云南等地［1］。傳統藏醫理論認為矮垂頭菊具有清熱解毒、祛風除濕的功效［1］。最新研究發現矮垂頭菊還具有一定的抗腫瘤活性［2］。課題組前期對多種青藏高原植物篩選發現，矮垂頭菊具有一定的抗缺氧活性［3］。本實驗擬對矮垂頭菊乙醇提取物的總黃酮和總多酚的含量、體外自由基清除活性及其對缺氧小鼠保護作用進行研究，從抗氧化的角度闡明其抗缺氧作用機制，為進一步將其開發成為抗高原缺氧藥物提供理論依據。

1 材料與儀器

1.1 藥物

矮垂頭菊購自青海西寧三江寶商貿有限公司，經蘭州大學藥學院生藥學研究所楊永建教授鑒定為菊科垂頭菊屬Cremanthodium humileMaxim 的花;干燥的矮垂頭菊200 g，粉碎后加入10 倍量70%乙醇浸泡過夜，超聲提取1 h，重復三次，合并提取液，過濾，減壓濃縮干燥得浸膏30 g，為矮垂頭菊乙醇提取物(Ethanol extract ofCremanthodium humile，EECH)。

1.2 動物

清潔級BABL/C 雄性小鼠，體重18～22 g，由蘭州軍區蘭州總醫院動物實驗科提供，許可證號SYXK(軍)2014-0029。

1.3 試劑

乙酰唑胺(100114)購自武漢遠城科技發展有限公司，1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)購自Sigma 公司;還原型輔酶I(NADH)、吩嗪硫酸甲酯(PMS)、抗壞血酸(VC)、硫代巴比妥酸(TBA)、硝普鈉、對氨基苯磺酸、鹽酸萘乙二胺購自阿拉丁試劑公司;蘆丁標準品(100080-200707)、沒食子酸標準品(110831-200804)購自中國食品藥品檢定研究院;其余均為國產分析純試劑。丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.4 主要儀器

Spectramax i3 多功能酶標儀(Molecular Devices公司);RE-3000A 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);SK3300L 超聲清洗器(上海精密儀器儀表有限公司);AE204 型電子天平(美梅特勒-托利多儀器有限公司);UV2800SPC 紫外可見分光光度計(上海舜宇恒平科學儀器有限公司)，FLYDWC50-IIC 低壓低氧動物實驗艙(貴州風雷航空軍械有限公司)。

2 實驗方法

2.1 DPPH 清除實驗

向125 μL 不同質量濃度的樣品溶液中分別加入125 μL 0.1 mmol/L DPPH 70%乙醇溶液，室溫下暗處反應30 min，以70%乙醇溶劑做空白對照，測量其在波長517 nm 處的吸光度Ai。將125 μL 70%乙醇溶液分別與125 μL DPPH 70%乙醇溶液和125 μL 樣品溶液混合后，測定其在波長517 nm 處的吸光度，分別計為A0和Aj。按式(1)計算其清除率，并計算其IC50。

2.2 羥自由基清除實驗

向500 μL 不同質量濃度樣品溶液中依次加入50 μL 28 mmol/L 脫氧核糖(溶于pH=7.0 的0.2 mmol PBS)、50 μL EDTA(1 mmol/L)、50 μL 的FeCl2(1 mmol/L)和50 μL H2O2(1 mmol/L)，最后加入50 μL 抗壞血酸(1 mmol/L)啟動反應，37 ℃水浴孵育1 h 后依次加入250 μL 三氯乙酸(10%)和250 μL TBA(0.5%，溶于25 mmol/L 的NaOH 溶液)，沸水中孵育0.5 h，測定532 nm 處吸光度Ai，用500 μL 蒸餾水代替樣品溶液，測得吸光度A0，用PBS 代替脫氧核糖測得吸光度Aj。按式(1)計算其清除率，并計算其IC50。

2.3 超氧陰離子清除實驗

向100 μL 不同質量濃度的樣品溶液中依次加入50 μL NADH(500 μmol/L，溶解于0.2 mol/L pH=7.4 的PBS 中)、50 μL NBT(200 μmol/L)和50 μL PMS(20 μmol/L)。混合均勻后室溫下反應8 min，測定其在560 nm 處的吸光度Ai。用100 μL 70%乙醇替代樣品，混合后測定其560 nm 處的吸光度A0;用50 μL 水取代PMS，混合后測定其在波長560 nm 處的吸光度Aj。按式(1)計算其清除率，并計算其IC50。

2.4 一氧化氮清除實驗

將100 μL 不同濃度的樣品溶液與100 μL 的硝普鈉(10 mmol/L，溶解在磷酸緩沖液中0.05 mol/L，pH 7.4)混合均勻后，室溫下孵育2.5 h，向混合溶液中加入900 μL 蒸餾水和0.5 mL 對氨基苯磺酸(33%，溶解在20% 的乙酸溶液中)，室溫放置5 min，最后加入0.5 mL 鹽酸萘乙二胺(0.1%，w/v)，室溫放置30 min 后，測定540 nm 處的吸光度Ai。用磷酸緩沖液代替硝普鈉時測得吸光度Aj，用70%乙醇代替樣品溶液時測得吸光度A0。按式(1)計算其清除率，并計算其IC50。

2.5 總黃酮含量測定

將50 μL NaNO2溶液(5%)加入到500 μL 的不同質量濃度的蘆丁標準品溶液(0～140 μg/mL)中，混合均勻。室溫下靜置6 min 后加入50 μL Al(NO3)3溶液(10%)，混勻后再靜置6 min，最后加入250 μL NaOH 溶液(4%)，再次混合均勻后靜置15 min，測定其在518 nm 處吸光值，每個樣品重復三次，取平均值。根據實驗結果建立標準曲線。根據蘆丁標準曲線，按照相同方法求得樣品中總黃酮含量。

2.6 總多酚含量測定

將1 mL Folin-Ciocalteu 試劑分別與100 μL 的不同質量濃度的沒食子酸標準品溶液(0～140 μg/mL)充分混合后，加入1 mL Na2CO3溶液(7%)，室溫放置5 h，測定其在760 nm 處吸光值，每個樣品重復三次，取平均值。根據實驗結果建立標準曲線。根據沒食子酸標準曲線，按照相同方法求得樣品中總酚含量。

2.7 常壓密閉缺氧實驗

將50 只清潔劑級雄性BABL/C 小鼠隨機分成5 組，缺氧模型組、乙酰唑胺組(300 mg/kg)、EECH低、中、高劑量組(125、250、500 mg/kg)，每組10只，連續灌胃給藥5 d，最后一次給藥60 min 后，將小鼠分別放入250 mL 廣口瓶內(瓶內含5 g 鈉石灰)，密封瓶口，立即開始計時，待小鼠停止呼吸時記錄小鼠存活時間。利用存活時間和延長率評價藥物的抗缺氧作用，確定EECH 最佳給藥劑量。延長率=(藥物組存活時間-缺氧模型組存活時間)/缺氧模型組存活時間。

2.8 低壓低氧實驗

將24 只SPF 級雄性BABL/C 小鼠隨機分成4組，正常組、缺氧模型組、乙酰唑胺組(300 mg/kg)、EECH 高劑量組500 mg/kg，每組6 只。給藥方式同2.7。最后一次給藥后，除正常組外，將其他3 組置于低壓低氧動物實驗艙中，以100 m/min 的速度減壓至模擬8000 m 海拔高度，并維持低壓低氧9 h，隨后快速升壓至正常氣壓。立即將小鼠脫臼處死，取大腦和心臟組織，用4 ℃生理鹽水制成10%的組織勻漿用于相關生化指標的測定。

2.9 指標檢測

MDA 含量、SOD、CAT 和GSH-Px 活性測定按照相應的試劑盒說明書進行。

2.10 統計學處理

3 實驗結果

3.1 EECH 對DPPH 清除作用

結果如圖1 所示，EECH 對DPPH 自由基的清除作用存在較好的劑量依賴性。在濃度為120 mg/mL 時，其對DPPH 的清除率達到了79.92%，EECH和Vc 的IC50分別為80.90 ± 0.47 和30.39 ± 0.43 μg/mL。以上結果表明，EECH 對DPPH 自由基具有較好清除能力，但是其活性明顯弱于Vc。

圖2 EECH 對·OH 的清除率Fig.2 Hydroxyl scavenging effect of EECH

3.2 EECH 對羥自由基清除作用

從圖2 結果可以看出:隨著EECH 濃度的升高，其對·OH 的清除能力逐漸增強，具有明顯的劑量依賴性，經計算其IC50為263.54 ± 6.82 μg/mL，顯著高于Vc(50.78 ± 2.45 μg/mL)。隨著濃度的增加，Vc 對·OH 的清除能力增加緩慢，而EECH 增長迅速，但仍弱于Vc。

圖3 EECH 對的清除率Fig.3 Superoxide radical scavenging effect of EECH

3.3 EECH 對超氧陰離子清除作用

結果如圖3 所示，當濃度低于200 μg/mL 時，隨著濃度的升高，EECH 和Vc 對的清除能力增加迅速，當濃度大于200 μg/mL 時，二者的清除能力增長速度明顯放緩，特別是Vc。總的來說，EECH 對的清除能力要高于Vc。其IC50值為291.43 ± 2.45 μg/mL，顯著低于Vc 的IC50值(462.81 ± 3.24 μg/mL)。

3.4 EECH 的對NO 的清除能力

圖4 EECH 對NO 的清除率Fig.4 Nitric oxide radical scavenging effect

結果如圖4 所示，EECH 和Vc 對NO 清除作用與對的清除作用類似，隨著濃度的升高，清除能力逐漸增加，但是增長的幅度越來越小。EECH的IC50(285.26 ± 4.45 μg/mL)明顯高于Vc(176.33 ± 5.76 μg/mL)，表明其對NO 的清除能力弱于Vc。

3.5 EECH 中總黃酮與總多酚含量

經檢測，EECH 中總黃酮的含量高達378.35 ±7.04 mg 蘆丁/g 提取物，多酚含量為114.58 ±0.99 mg 沒食子酸/g 提取物。

3.6 EECH 對常壓密閉缺氧小鼠存活時間的影響

從表1 結果可以看出:缺氧模型組小鼠在250 mL 廣口瓶內的存活時間為32.15 ±1.08 min，陽性藥乙酰唑胺組可以顯著延長存活時間至42.24 ±1.63 min(P＜0.01)，延長率為31.38%。EECH 三組存在明顯則劑量依賴性，低劑量組的存活時間略長于模型組，但是低于乙酰唑胺組，中劑量組的存活時間為44.12 ±3.25 min，效果與乙酰唑胺相當，而高劑量組的存活時間達到47.37 ±2.56 min，延長率為47.34%，顯著高于缺氧模型組(P＜0.01)和乙酰唑胺組(P＜0.05)。因此，在后續實驗中采用高劑量進行相關指標測定。

表1 EECH 對常壓密閉缺氧小鼠存活時間的影響(n=10，±s)Table 1 Effects of EECH on the survival time of mice under normobaric hypoxia condition (n=10，±s)

表1 EECH 對常壓密閉缺氧小鼠存活時間的影響(n=10，±s)Table 1 Effects of EECH on the survival time of mice under normobaric hypoxia condition (n=10，±s)

注:與模型組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與乙酰唑胺組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01。Note:Compared with model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;Compared with Acetazolamide group，#P ＜0.05，##P ＜0.01.

3.7 EECH 對低壓低氧小鼠心腦組織中MDA 含量的影響

結果如圖5 所示，對所有組別而言，腦組織中MDA 含量顯著低于心肌組織。與正常組比較，缺氧模型組小鼠心、腦組織MDA 含量顯著升高(P＜0.01)，經乙酰唑胺和EECH 預處理后，缺氧小鼠心、腦組織中MDA 含量顯著降低(P＜0.01 或P＜0.05)。

圖5 EECH 對低壓低氧小鼠心腦組織中MDA 含量的影響(n=6，±s)Fig.5 Effects of EECH on the MDA content in brain and heart of mice under hypobaric hypoxia condition (n=6，±s)

3.8 EECH 對低壓低氧小鼠心腦組織中SOD、CAT和GSH-Px 活性的影響

結果如表2 所示，與正常組比較，缺氧模型組小鼠心、腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活性顯著降低(P＜0.01);與模型組比較，經乙酰唑胺和EECH 預處理后，小鼠心、腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活力均顯著升高。但是EECH 的效果顯著優于乙酰唑胺。

4 討論

表2 EECH 對低壓低氧小鼠心腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活性的影響(n=6，±s)Table 2 Effects of EECH on the levels of SOD，CAT，GSH-Px and T-AOC in brain and heart of mice under hypobaric hypoxia condition (n=6，±s)

表2 EECH 對低壓低氧小鼠心腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px 活性的影響(n=6，±s)Table 2 Effects of EECH on the levels of SOD，CAT，GSH-Px and T-AOC in brain and heart of mice under hypobaric hypoxia condition (n=6，±s)

注:與正常組相比，#P ＜0.05，##P ＜0.01;與模型組相比，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01。Note:Compared with normal group，#P ＜0.05，##P ＜0.01;Compared with model group，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01.

矮垂頭菊常年生長在低壓低氧的環境中，為了抵抗氧化應激，其體內可能含有具有優異抗氧化活性的物質。為了證明上述猜想，本研究首先考察了EECH 對和NO 的清除作用。DPPH 是一種穩定的含氮自由基，其乙醇溶液呈深紫色，自由基清除劑會使其顏色變淺。該法具有操作簡便、靈敏度高的特點，已經廣泛用于樣品，特別是植物提取物樣品的抗氧化活性測定［7］。·OH 被認為是ROS 中活性最強的自由基，它能夠無選擇性的攻擊幾乎所有生物大分子，造成細胞損傷。研究表明:心血管疾病、腫瘤、糖尿病以及阿爾茲海默病的發生均與·OH 有關［8］。自身活性較弱，但是其能夠在體內轉化成活性更強的H2O2和·OH［9］。NO 是體內重要的功能分子，發揮著血壓調節、神經信號傳遞、控制血管舒張和松弛平滑肌等眾多生理功能。但是NO 還會與反應生成氧化性更強的過氧亞硝酸根離子(ONOO-)，從而導致組織器官氧化損傷［10］。從文中結果可以看出:矮垂頭菊乙醇提取物對DPPH、·OH 和NO 的清除能力弱于Vc，但其對的清除能力明顯優于Vc。總的來說，EECH 對四種自由基均表現出一定的清除活性，盡管活性弱于Vc，但仍是一種非常有前景的天然抗氧化劑。

黃酮和多酚是植物體內含有的非常重要的次生代謝產物，也是許多植物提取物抗氧化作用的物質基礎［11］。通過對EECH 的總黃酮和總多酚的含量進行測定，結果表明:其高濃度的總黃酮可能其發揮抗氧化作用的物質基礎。

盡管低壓低氧對機體產生損傷的作用機制尚不完全明確，但是自由基代謝紊亂是損傷產生的重要原因之一。有研究指出:通過攝取抗氧化劑，例如維生素E 和乙酰左旋肉堿等能夠減輕低壓低氧造成的損傷［12，13］。為此，本研究首先利用小鼠常壓密閉缺氧實驗考察了自由基清除劑EECH 的抗缺氧能力。結果表明:灌胃給藥高、中、低劑量的EECH 均能不同程度地延長缺氧小鼠的存活時間，且呈劑量依賴性，其中，EECH 最高劑量組表現出顯著優于乙酰唑胺的抗缺氧效果。

大腦和心臟是機體中氧代謝最為活躍的器官，這也造成它們對低壓低氧非常敏感［14，15］。為了闡明EECH 對低壓低氧小鼠心腦組織的保護作用，本研究對心腦組織中自由基代謝相關生化指標進行了考察。

MDA 是脂質過氧化的最終產物之一，其含量可以反映脂質過氧化的程度［16］。低壓低氧會導致小鼠心腦組織中MDA 含量顯著升高，經EECH 預處理后，小鼠心腦組織中MDA 含量降低明顯，說明EECH 對低壓低氧誘導的脂質過氧化有抑制作用。

SOD、CAT 和GSH-Px 是機體內重要的抗氧化酶，被認為是抵抗氧化應激損傷的第一道防線。SOD 可以通過歧化反應將·OH 轉化為H2O2。生成的H2O2又可以進一步被CAT 和GSH-Px 清除，三者協同維持機體內自由基代謝的穩態［17］。低壓低氧會導致小鼠心腦組織中SOD、CAT 和GSH-Px的活性顯著降低，抗氧化系統被破壞，導致自由基代謝紊亂和ROS 大量蓄積。EECH 能夠提高低壓低氧條件下小鼠心腦組織中抗氧化酶的活性，維持機體內自由基代謝穩態，減少低壓低氧誘導的氧化應激損傷。

綜上所述，矮垂頭菊乙醇提取物表現出優異的體外自由基清除活性，是一種高效的天然抗氧化劑，其含有的高濃度總黃酮，可以作為獲得黃酮類化合物的天然來源。體內實驗研究表明:矮垂頭菊乙醇提取物能夠顯著延長缺氧小鼠的存活時間，緩解低壓低氧對小鼠心腦組織的損傷，其機制可能與維持機體抗氧化酶的活性、調節自由基代謝有關。

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