山橙葉粗提物的殺蟲活性研究

許亞楠，熊 婷，曾東強，劉曉亮，唐文偉

廣西大學農藥與環境毒理研究所，南寧 530005

山橙Melodinus suaveolens，又名馬騮藤、猢猻果、猴子果，為夾竹桃科山橙屬植物，主要分布于我國廣東、廣西等地;果實具有行氣、止痛、除濕、殺蟲等功效，用于治療胃氣痛、膈癥、疝氣、瘰疬、皮膚熱毒、濕癬疥癩［1］。近年來，山橙屬植物以其含有結構新穎的單萜吲哚型生物堿引起了一些學者的關注［2，3］。目前，對山橙的研究僅限于化學成分的分離和鑒定。迄今為止，國內外學者從山橙枝葉中已分離60 余種化合物，主要為生物堿類成分［4-7］。關于其活性的研究主要集中在對癌細胞的抑制方面，在農業方面的活性罕有涉及。張方平等人在研究25 種熱帶植物乙醇粗提物對比哈小爪螨P.citri驅避作用時，發現山橙的乙醇粗提物對比哈小爪螨的產卵驅避率達到100%，對成螨的驅避率達到94%［8］。這說明該植物在防治農業害蟲方面的活性值得進一步探索。

本研究通過同時蒸餾萃取法(SDE)從山橙葉中提取精油，對其在防治農業害蟲方面的活性進行了初步探索，為山橙資源的開發利用提供了科學依據。通過測定山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬、柑橘全爪螨的殺蟲活性，為進一步挖掘山橙的應用價值提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

山橙M.suaveolens，采自廣西十萬大山，由廣西林業勘探設計院鐘業聰高級工程師鑒定;榕管薊馬G.uzeli采自廣西大學實驗基地，寄主為雅榕Ficus concinnaMiq.。柑橘全爪螨P.citri采自廣西大學實驗基地，寄主為毛葉棗Zizyphus mauritianaLam.。試蟲采集回后室內飼養，第2 代作為生測蟲源;正己烷、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、氯化鈉均為分析純。

1.2 儀器與設備

同時蒸餾萃取裝置(安徽天長市長城玻璃儀器制造廠);98-1-C 型電子調溫電熱套(天津市泰斯特儀器有限公司);HH-S 電子恒溫水浴鍋(金壇市醫療儀器廠);RE-52AA 旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);冷卻水循環器(施都凱儀器設備上海有限公司);電子天平PL203(梅特勒—托利多儀器上海有限公司);高倍體視顯微鏡(德國ZEISS 公司);光照培養箱(金壇市天宏實驗儀器廠)。

1.3 實驗方法

1.3.1 植物粗提物的提取

將采集的供試材料，分別放在通風處陰干，粉碎。將植物粉末38 kg 分置入大型容器(20 L)中，用5 倍量(體積比)的甲醇在室溫下用冷浸法提取，72 h 后過濾，收集濾液，共提取3 次，合并濾液，濾液用旋轉蒸發儀蒸餾濃縮，合并多次濃縮物得到植物的甲醇粗提物，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 植物粗提物的萃取分離

將山橙甲醇粗提物3.7 kg 用蒸餾水充分熱溶(水溫低于50 ℃)，裝入分液漏斗懸浮，分別用等體積石油醚、乙酸乙酯萃取3 次，減壓濃縮得石油醚層(403 g)、乙酸乙酯(667 g)和水層(504 g)濃縮稠膏，置冰箱中冷藏備用。

1.3.3 山橙精油的提取

準確稱量山橙的新鮮葉片50 g，剪成面積為1～2 cm2左右的碎片，置于1000 mL 圓底燒瓶中。按規定水料比加入蒸餾水，溶解一定量的NaCl，輕輕振搖2 min，使水淹沒葉片。浸泡適當時間后，將燒瓶接入同時蒸餾萃取裝置的沸水蒸餾端;另取一500 mL 圓底燒瓶，加入120 mL 正己烷，接入同時蒸餾萃取的水浴端(70 ℃恒溫);打開水浴鍋和電熱套開關，加熱至水和正己烷沸騰，控制加熱溫度和冷凝水流速，以使隨水蒸氣上升的精油在冷凝后及時并充分地轉移至正己烷中。裝有葉片的燒瓶停止加熱后，需繼續供應正己烷蒸氣10 min 左右。同時蒸餾萃取結束后，收集正己烷萃取液，使用旋轉蒸發儀進行濃縮，濃縮至3～5 mL 后，用N2吹出殘留溶劑得到油狀物即為山橙葉精油。

1.3.4 生物活性測定

1.3.4.1 榕管薊馬的生物活性測定

參考Alfredo 和Anthon 的TIBS 法［9］，經適當修改建立葉管藥膜法。將供試樣品以丙酮溶解，再加蒸餾水配制對應濃度(丙酮含量不超過5%)。用移液管取適量藥液加入到20 mL 的玻璃指形瓶中，均勻滾動，使藥液在玻璃指形瓶內壁形成均勻的藥膜。再將小葉榕的新鮮葉片(2 cm×3 cm)在藥液中浸5 s，取出自然晾干再放入藥膜瓶中，用毛筆輕輕移入30 頭左右的榕管薊馬成蟲，用保鮮膜封口(扎小孔)，處理過的試蟲置于25 ±1 ℃，RH 75%的光照培養箱中，24 h 后調查死亡率。每個處理3 次重復，設5%丙酮的蒸餾水作對照。

1.3.4.2 柑橘全爪螨的生物活性測定

參照FAO(聯合國糧農組織)推薦的玻片浸漬法［10，11］并加以改進。供試樣品以丙酮溶解，再加蒸餾水配制對應濃度(丙酮含量不超過5%)。用柔軟的細毛筆輕輕挑選雌成螨，將其背部粘在雙面膠帶上(注意不能粘住螨足、螨須、口器)，每片粘3 行，每行10 頭左右，剔除死亡或生命力較弱的個體并補充。將帶螨玻片的一端浸入藥液中5 s 左右后取出，迅速用吸水紙吸干螨體及其周圍多余的藥液，然后將處理過的試蟲放置于溫度為25 ± 1 ℃，RH 75%的光照培養箱中，24 h 后，在雙目解剖鏡下檢查結果，用毛筆輕觸螨體，螨足不動視為死亡。每處理3 次重復，設含5%丙酮的蒸餾水對照。

1.3.5 數據分析

采用SPSS 17.0 及Excel 進行統計分析，LC50值及毒力回歸方程均使用概率值法計算，方差分析采用鄧肯氏極差多重比較法(Duncan’s Multiple Ranger Test，DMRT)。

2 結果與分析

2.1 十一種植物粗提物對榕管薊馬的殺蟲活性

在10 mg/mL 濃度下，以藥膜法測定了采自廣西十萬大山的十一種植物甲醇粗提物對榕管薊馬成蟲的殺蟲活性。結果如表1。

表1 十一種植物甲醇粗提物對榕管薊馬的殺蟲活性(10 mg/mL)Table 1 Insecticidal toxicities of the methanol extracts of 11 plants against the G.uzeli at the concentration of 10 mg/mL

從11 種植物甲醇粗提物對榕管薊馬的生物活性測定結果可以看出，山橙葉粗提物對榕管薊馬具有顯著的生物活性，處理后72 h 校正死亡率達到76.89%;毒根斑鳩菊次之，處理后72h 校正死亡率為60.32%;狹葉坡壘和山橙果對榕管薊馬活性較弱，處理后72h 校正死亡率均為50%左右;尖山橙、土常山、山菅蘭、鋸葉竹節樹對榕管薊馬的活性微弱，杜蚣花、大山橙和龍州山橙果對其無顯著活性。

2.2 山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬的殺蟲活性

針對活性篩選結果中山橙葉粗提物對榕管薊馬具有顯著的生物活性，進一步采用改進后的葉管藥膜法測定山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬處理24 h后的毒力，結果如表2。

表2 山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬的毒力Table 2 The toxicity of the methanol extract and essential oil from M.suaveolens leaves against G.uzeli

生物測定結果顯示，山橙葉精油對榕管薊馬活性較弱，山橙葉粗提物對榕管薊馬活性較好，處理24 h 后的LC50值為12.7271 mg/mL。

2.3 山橙葉粗提物各萃取層對榕管薊馬的殺蟲活性

為了進一步探究活性成分在山橙枝葉中的分布部位，本研究對山橙葉甲醇粗提物進行了萃取分離，測定了山橙葉粗提物各萃取層在10 mg/mL 濃度下對榕管薊馬的生物活性，結果如下表3。

綜合分析山橙葉粗提物各萃取層對榕管薊馬的活性，結果表明山橙粗提物中對榕管薊馬具有活性的物質主要集中于乙酸乙酯萃取層中。在10 mg/mL 的濃度下，處理24 h 后的校正死亡率為72.30%，處理48 h 后的校正死亡率為96.33%。并進一步測定了乙酸乙酯萃取層對榕管薊馬的毒力，結果如表4，處理24 h 后LC50值為4.9507 mg/mL，處理48 h 后LC50值為2.0384 mg/mL，處理72 h 后LC50值為1.5042 mg/mL。這一結果表明有必要對山橙甲醇粗提物的乙酸乙酯萃取層進一步分離，從而找到對榕管薊馬具有殺蟲活性的化合物。

表3 山橙葉粗提物各萃取層(10 mg/mL)對榕管薊馬成蟲的殺蟲活性Table 3 Insecticidal activity of different fractions of M.suaveolens leaves against G.uzeli at the concentration of 10 mg/mL

表4 山橙葉粗提物乙酸乙酯層對榕管薊馬的毒力Table 4 The toxicities of EtOAc-soluble of M.suaveolens leaves against G.uzeli

2.4 山橙葉粗提物及精油對柑橘全爪螨的生物活性

目前，尚未有關于山橙活性成分在農業害蟲防治方面的報道，僅有只字片語涉及到山橙粗提物對螨的活性，結果不詳。為了便于比較，本研究除了系統地測定了山橙葉粗提物及精油對榕管薊馬的活性外，還采用玻片浸漬法測定了山橙葉粗提物及精油對柑橘全爪螨雌成螨的毒力。處理24 h 后的結果如表5。

表5 山橙葉粗提物及精油對柑橘全爪螨雌成螨的毒力Table 5 The toxicity of the methanol extract and essential oil from M.suaveolens leaves against P.citri

表5 的結果表明，山橙葉精油對柑橘全爪螨雌成螨具有顯著的殺蟲活性，處理后24 h 的LC50值為0.4142 mg/mL。而山橙葉粗提物對柑橘全爪螨活性較弱，處理后24 h 的LC50值為5.5524 mg/mL。從而可以推斷對柑橘全爪螨具有殺蟲活性的成分存在于精油中，而非山橙葉粗提物中。今后可對山橙葉精油化學成分做進一步分析，尋找對柑橘全爪螨具有殺蟲活性的化學成分。

3 討論與結論

本實驗對十一種植物粗提物進行了活性篩選，測定了不同濃度的山橙葉粗提物、精油對榕管薊馬、柑橘全爪螨雌成螨的殺蟲活性，以及山橙各萃取層對榕管薊馬的殺蟲活性。以往文獻中對殺蟲活性成分進行追蹤時主要采取分離純化，對精油的研究尚屬空白，本實驗首次通過SDE 法提取了山橙葉精油，并對其進行了活性測定，從而為準確定位活性成分存在部位奠定了基礎。其中，山橙葉粗提物及精油對柑橘全爪螨表現較好的觸殺活性，處理24 h 后LC50值分別為5.5524、0.4142 mg/mL。今后有必要對山橙葉精油深入研究，以尋找對柑橘全爪螨有活性的化學成分。山橙葉粗提物乙酸乙酯萃取層對榕管薊馬處理48 h 后的LC50值為2.0384 mg/mL，但山橙葉精油對榕管薊馬活性較低。從而推測，山橙葉中對榕管薊馬具有殺蟲活性的成分集中在乙酸乙酯層，對柑橘全爪螨具有殺蟲活性的成分存在于精油中。實際生產中，對榕管薊馬的防治多采用化學措施，容易造成害蟲抗藥性增強、藥害等問題，本研究結果可為研發防治榕管薊馬的新藥劑提供思路。

目前，尚未有關于山橙葉精油對柑橘全爪螨的殺螨活性的研究報道。作為一種世界性的柑橘害螨，柑橘全爪螨通過吸食柑橘葉片、嫩梢、花蕾和果實的汁液造成減產、品質下降和樹體早衰。當前防治該害蟲的主要手段仍然是施用化學農藥，但化學農藥長期不合理使用嚴重影響了果品質量安全，并造成柑橘全爪螨的抗藥性增強和生態環境的破壞，更限制了我國柑橘的出口貿易［12］。因此，研究開發新的高效、低毒、對環境友好的植物源殺螨劑對柑橘生產具有重要意義。本研究結果顯示山橙葉精油對柑橘全爪螨活性較好，有必要進一步研究萃取條件對精油提取率的影響，從而為山橙精油的應用及殺螨新藥的研制提供理論依據。

本研究采用同時蒸餾萃取法(SDE)提取了山橙葉精油，可大幅度節省萃取時間。相比傳統的水蒸氣蒸餾法，不僅節省了溶劑，而且免去人為操作帶來的污染，較為可取。

綜上所述，研究結果顯示了山橙在農業害蟲防治領域的開發和應用前景，據此推測山橙所含活性成分在農業害蟲防治方面的潛力巨大。今后，需進一步系統分離山橙葉甲醇粗提物的乙酸乙酯萃取層，并研究其對榕管薊馬的作用機理。同時，有必要研究山橙葉精油有效成分的分離、提取，探究山橙葉精油對柑橘全爪螨的作用方式、作用機理等。通過這樣一系列的研究，可探索山橙在農業害蟲防治方面的價值，為進一步探究山橙精油化學成分，尤其是開發利用山橙中對榕管薊馬具有殺蟲活性的天然產物成分提供了理論依據。

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